Isolando células ganglionares da retina murina usando classificação de células ativadas por fluorescência

Coloque uma retina murina em um filtro de células umedecido e macere em movimentos circulares para separar as células da retina da matriz extracelular.

Transfira o filtro para um tubo de coleta.

Adicione um tampão fosfato e uma solução de soro ao filtro para lavar e coletar as células.

Centrifugue para assentar as células. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num tampão fosfato e numa solução de soro.

Adicione anticorpos bloqueadores que se ligam aos receptores Fc nas células, impedindo a ligação não específica de anticorpos alvo.

Em seguida, adicione anticorpos primários marcados com e sem marcação fluorescente que se ligam a marcadores específicos de superfície celular em vários tipos de células.

Lave para remover anticorpos não ligados.

Adicione um anticorpo secundário marcado com fluorescência para se ligar ao anticorpo primário não marcado.

Lave para remover anticorpos não ligados.

Realize a classificação de células ativadas por fluorescência, ou FACS, para capturar os sinais fluorescentes distintos das células marcadas e classificar as células ganglionares da retina de várias populações de células da retina.

Coloque até 12 retinas em um filtro de náilon estéril de 70 mícrons umedecido com PBS e FBS e macere suavemente a retina com a extremidade traseira de um êmbolo de seringa de 10 mililitros usando um movimento circular. Quando todas as células estiverem dissociadas, coloque o filtro sobre um tubo de coleta de polipropileno e use uma pipeta P1000 para filtrar as células através do filtro para o tubo de coleta.

Enxágue o filtro com PBS e FBS, acumulando a lavagem no tubo de coleta. Adicione PBS mais FBS suficiente para aumentar o volume final de até 1 mililitro de solução por retina e colete as células por centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet em PBS mais FBS a 1 mililitro de meio por 5 retinas Em seguida, bloqueie qualquer ligação inespecífica do receptor FC em cada tubo com 1 microlitro de anticorpo anti-camundongo CD16/32 por 1 x 10⁶ células por 10 minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação de bloqueio, adicione o coquetel de anticorpos de interesse às células com pipetagem suave para uma incubação de 30 minutos em gelo protegido da luz. Em seguida, lave as células duas vezes em um volume final de 4 mililitros de PBS e FBS. Rotular as células com um anticorpo secundário apropriado por mais 30 minutos em gelo protegido da luz, seguido de 2 lavagens em PBS mais FBS, e carregar o tubo de amostra no citômetro de fluxo.