Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular
June 14th, 2011
A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.
O objetivo geral do experimento a seguir é criar microambientes celulares para estudar questões biológicas relacionadas a comportamentos celulares individuais e em grupo que ocorrem em dimensões micro e nanoescala. Isso é conseguido primeiro projetando modelos que, em última análise, orientarão o posicionamento das células. Em seguida, esses projetos são então traduzidos em superfícies padrão por meio de fotolitografia, o que permite a criação de moldes de blindagem de plasma por meio de litografia suave.
Finalmente, esses moldes de blindagem são dispostos como um tripé em uma placa de Petri para permitir a exposição seletiva das superfícies subjacentes ao plasma, o que deixará um padrão químico sensível à célula nas áreas sob cada molde. Podem ser obtidos resultados que mostram como o comportamento de uma célula depende de seu microambiente e de sua interação com as células vizinhas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre os efeitos dos microambientes no comportamento celular, como as interações entre grupos de células afetam fenômenos de ordem superior?
E como as pistas subcelulares em nanoescala afetam funções como migração e diferenciação da saúde? Primeiro, use super cola para prender um slide de padrão a uma pilha de slides em branco. Em seguida, crie um recipiente de papel alumínio um pouco maior do que a pilha de lâminas e grande o suficiente para conter 30 gramas de polidimetil suboxano ou PDMS.
Coloque a pilha de lâminas no recipiente e, em seguida, coloque o PDMS sobre a pilha de lâminas para criar um molde inicial. Em seguida, desgaseifique o PDMS colocando o recipiente dentro de uma câmara de vácuo. Quebre todas as bolhas presentes no PDMS removendo e recolocando rapidamente um dedo sobre a tubulação da válvula de admissão várias vezes para permitir que o ar flua brevemente para a câmara.
A válvula é fechada por cinco minutos de desgaseificação ininterrupta. Em seguida, deixe o PDMS curar na coifa limpa à temperatura ambiente por um a dois dias. Uma vez curado, o PDMS é retirado do padrão mestre, formando um molde.
Em seguida, despeje uma fina camada de seis gramas de epóxi de duas partes que acabou de ser misturado por um minuto no molde mestre. Desgaseifique o epóxi imediatamente usando muitos ciclos de quebra de bolhas antes que o epóxi endureça. Depois que o epóxi Degas permanecer sem ser perturbado por uma hora, ele será parcialmente curado.
Adicione mais epóxi ao molde sem desgaseificação para produzir uma estrutura mais espessa que será mais fácil de manusear em etapas posteriores. Em seguida, deixe o epóxi curar por um a dois dias. Uma vez que o molde epóxi esteja curado, remova o epóxi do molde mestre PDMS e, em seguida, enrole a fita ao redor do molde epóxi para formar um recipiente.
Um molde de trabalho pode então ser criado despejando o PDMS no molde de epóxi, desgaseificando o PDMS e curando o novo molde por um a dois dias. Depois que o molde de trabalho estiver curado, retire o molde do epóxi e armazene ambos dentro de placas de Petri em um recipiente de plástico selado dentro da coifa de fluxo para manter a limpeza. Para preparar um molde para padronização de superfície, corte pequenas seções do molde de trabalho com uma lâmina de barbear e coloque as seções em uma placa de Petri.
As localizações dessas seções do molde são rotuladas na parte traseira da placa de Petri com um marcador permanente, fazendo um contorno ao redor de onde as seções do molde estão assentadas, forme um tripé a partir das seções e aguarde o tripé para garantir o contato conforme entre o molde de trabalho e a superfície da placa de Petri. Olhe para a parte inferior do prato para confirmar um bom posicionamento, como evidenciado pela presença de canais que podem ser vistos a olho nu ou com uma pequena lente de aumento. Coloque o conjunto em uma câmara de plasma.
Inicie o tratamento com plasma após o tratamento com plasma. Remova o arranjo de molde e peso e coloque a placa de Petri dentro de um gabinete de biossegurança sob luz ultravioleta por 10 minutos para esterilização. Guarde o prato lá até que esteja semeado com células.
Dilua as células experimentais de escolha em seus meios de cultura padrão para obter a confluência desejada. Quando colocado na superfície da placa de Petri padronizada, despeje três mililitros da solução celular na placa de Petri. Incube a placa de Petri padronizada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, 100% de umidade por várias horas a vários dias para permitir que as células se montem no padrão criado pela célula plasmática.
A padronização é verificada com microscopia de contraste de fase. Ao cultivar células de neuroblastoma, adicione 10 micromolares de ácido retinóico diariamente até que a diferenciação celular em um estado semelhante ao neurônio seja observada. Substitua o meio de cultura celular padrão a cada três ou quatro dias.
Um resultado típico da implementação da técnica de litografia de plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a alguma estrutura arbitrária ou natural. Um exemplo disso pode ser visto aqui nesta figura com neurônios que foram diferenciados com ácido retinóico em um padrão de linhas. E aqui nesta figura onde linhas e redes de neurônios foram criadas, outros tipos de células além dos neurônios também podem ser usados como visto nas próximas duas figuras, esta figura mostra células endoteliais da veia umbilical humana, e esta figura mostra C duas células musculares esqueléticas C 12 formando grades como visto. Aqui.
Materiais como a polilisina também podem ser padronizados para facilitar a fixação de certos tipos de células e para outros usos Após este procedimento, a incorporação de insumos adicionais, como microfluídica, sondagem celular ou manipulação genética de proteínas específicas, pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como como as combinações de estímulos afetam o comportamento celular individual e de ordem superior?
Visão Geral
Uma técnica versátil de litografia por plasma foi desenvolvida para criar padrões de superfície estáveis que orientam a fixação celular. Este método permite a formação de redes celulares que imitam tecidos naturais e facilita o estudo de vários tipos de células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Neurociência
- Biomateriais
Fundamentos
- Compreender o comportamento celular em dimensões micro e nano é crucial para a pesquisa biológica.
- Os microambientes celulares influenciam significativamente os comportamentos celulares individuais e em grupo.
- A litografia por plasma fornece um método para criar ambientes controlados para estudar esses comportamentos.
- Técnicas anteriores careciam de versatilidade na padronização para vários tipos de células.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para criar microambientes celulares que orientem a colocação celular.
- Investigar como os microambientes afetam o comportamento e as interações celulares.
- Explorar as implicações de sinais em nanoescala nas funções celulares, como migração e diferenciação.
Métodos Utilizados
- Projetando modelos para colocação celular.
- Usando fotolitografia para criar moldes de blindagem por plasma.
- Aplicando tratamento por plasma para gerar padrões químicos em superfícies.
- Semeando células em superfícies padronizadas e observando seu comportamento.
Principais Resultados
- Formação bem-sucedida de padrões celulares que se assemelham a estruturas naturais.
- Diferenciação demonstrada de células de neuroblastoma em estados semelhantes a neurônios.
- Interações observadas entre diferentes tipos de células em superfícies padronizadas.
- Destaque do papel dos microambientes na influência do comportamento celular.
Conclusões
- A técnica de litografia por plasma é eficaz para estudar o comportamento celular em ambientes controlados.
- Este método pode ser adaptado para vários tipos de células e questões de pesquisa.
- Estudos futuros podem incorporar técnicas adicionais para explorar ainda mais as interações celulares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Plasma lithography surface patterning enables precise engineering of cell microenvironments, supporting high-resolution studies of cell behavior and interaction. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses and advancing predictive models of tissue formation and cellular signaling. The method's stability and compatibility with diverse cell types position it as a reusable platform for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of cellular responses to defined microenvironmental cues.
- Supports mechanistic de-risking by isolating variables such as migration, adhesion, and differentiation.
- Facilitates functional target validation through controlled cell network formation.
- Improves predictive confidence in pathway and phenotype-based discovery.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible patterned substrates for quantitative cell-based assays.
- Enables scalable preparation of assay-ready surfaces for compound screening.
- Supports robust evaluation of cell behavior under defined spatial constraints.
- Allows for platform reuse across multiple cell types and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell networks with disease-relevant tissue architectures for translational continuity.
- Facilitates long-term studies of differentiation, adaptation, and cell-cell signaling.
- Supports risk-adjusted advancement of preclinical models by enabling discrete manipulation of cellular environments.
- Enhances biomarker discovery through controlled observation of cell interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This plasma lithography method integrates from early discovery through assay development and into preclinical research, enabling seamless hypothesis testing and model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of cell behavior and network formation under defined chemical patterns.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing cellular responses to experimental variables.
- Analytics: Provides high-content readouts for migration, adhesion, and differentiation metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking native tissue structures.
- Enterprise Reuse: Offers a stable, biocompatible platform adaptable to multiple R&D programs and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible patterned substrates for diverse workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, photolithography, and cell culture techniques.
- Needs access to plasma chambers, clean flow hoods, and microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across experiments and sites.
- Adaptable to various polymeric substrates and compatible with multiple cell types.
- Pattern stability supports long-term studies but may require optimization for specific applications.
