Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

O objetivo geral do seguinte experimento é criar microambientes celulares para estudar questões biológicas relacionadas a comportamentos celulares individuais e em grupo que ocorrem em dimensões na escala micro e nanométrica. Isso é alcançado primeiramente projetando modelos que, em última instância, orientarão o posicionamento celular. Em seguida, esses projetos são transformados em superfícies padronizadas por meio da fotolitografia, o que permite a criação de moldes de blindagem de plasma por litografia macia.

Por fim, esses moldes de blindagem são dispostos como um tripé em uma placa de Petri para permitir a exposição seletiva das superfícies subjacentes ao plasma, o que deixará um padrão químico sensível a células nas áreas sob cada molde. Os resultados podem demonstrar como o comportamento de uma célula depende do seu microambiente e de sua interação com células vizinhas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre os efeitos dos microambientes no comportamento celular, como, por exemplo, como as interações entre grupos de células afetam fenômenos de ordem superior?

E como sinais subcelulares em escala nanométrica afetam funções como migração celular e diferenciação? Primeiro, use cola super forte para fixar uma lâmina com padrão a uma pilha de lâminas em branco. Em seguida, crie um recipiente de folha de alumínio ligeiramente maior que a pilha de lâminas, e grande o suficiente para conter 30 gramas de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS.

Coloque a pilha de lâminas no recipiente e, em seguida, despeje PDMS sobre a pilha de lâminas para criar um molde inicial. Em seguida, desgaseifique o PDMS colocando o recipiente dentro de uma câmara de vácuo. Elimine quaisquer bolhas presentes no PDMS removendo e substituindo rapidamente um dedo sobre a tubulação da válvula de entrada várias vezes, permitindo brevemente que o ar entre na câmara.

A válvula é mantida fechada por cinco minutos de desgaseificação ininterrupta. Em seguida, deixe a PDMS curar na câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente por um a dois dias. Após o curativo, a PDMS é destacada do molde mestre, formando um molde.

Em seguida, despeje uma camada fina de seis gramas de epóxi bifásico recém-misturado por um minuto dentro do molde mestre. Desgaseifique imediatamente o epóxi utilizando vários ciclos de rompimento de bolhas antes que o epóxi endureça. Após deixar o epóxi desgaseificado em repouso, sem perturbações, por uma hora, ele estará parcialmente curado.

Adicione mais epóxi ao molde sem dessonificar para produzir uma estrutura mais espessa, que será mais fácil de manipular nas etapas posteriores. Em seguida, deixe o epóxi curar por um a dois dias. Após o epóxi ter curado, remova-o do molde mestre de PDMS e, então, enrole fita ao redor do molde de epóxi para formar um recipiente.

Uma matriz de trabalho pode então ser criada despejando PDMS sobre a matriz de epóxi, desgaseificando o PDMS e curando a nova matriz por um a dois dias. Após a cura da matriz de trabalho, desprenda a matriz do epóxi e armazene ambas dentro de placas de Petri em um recipiente plástico fechado dentro da câmara de fluxo laminar para manter a limpeza. Para preparar uma matriz para padronização de superfície, corte pequenas seções da matriz de trabalho com uma lâmina de barbear e coloque as seções em uma placa de Petri.

As localizações dessas seções do molde são rotuladas no verso da placa de Petri com uma caneta permanente, fazendo um contorno ao redor das áreas onde as seções do molde estão posicionadas, formando um tripé a partir das seções e aguardando o tripé para garantir o contato conformal entre o molde ativo e a superfície da placa de Petri. Observe a parte inferior da placa para confirmar o bom posicionamento, evidenciado pela presença de canais visíveis a olho nu ou com uma pequena lente de aumento. Coloque o conjunto em uma câmara de plasma.

Inicie o tratamento com plasma após o tratamento com plasma. Remova o molde e a disposição de pesos e coloque a placa de Petri dentro de uma cabine de segurança biológica sob luz UV por 10 minutos para esterilização. Armazene a placa nesse local até que seja semada com células.

Dilua as células experimentais de escolha em seu meio de cultura padrão para atingir a confluência desejada. Quando colocadas sobre a superfície do recipiente de Petri padronizado, despeje três mililitros da solução celular no recipiente de Petri. Incube o recipiente de Petri padronizado a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, umidade de 100% por várias horas a vários dias para permitir que as células se organizem no padrão criado pela célula de plasma.

A padronização é verificada por microscopia de contraste de fase. Ao cultivar células de neuroblastoma, adicione 10 micromolares de ácido retinóico diariamente até que a diferenciação celular em um estado semelhante ao de um neurônio seja observada. Substitua o meio de cultura celular padrão a cada três ou quatro dias.

Um resultado típico da implementação da técnica de litografia por plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a alguma estrutura arbitrária ou natural. Um exemplo disso pode ser visto nesta figura, com neurônios que foram diferenciados com ácido retinóico sobre um padrão de linhas. E nesta figura, onde foram criadas linhas e redes de neurônios. Outros tipos celulares além dos neurônios também podem ser utilizados, conforme mostrado nas próximas duas figuras; esta figura mostra células endoteliais de veia umbilical humana, e esta figura mostra células musculares esqueléticas C2C12 formando grades, como visto aqui.

Materiais como polilisina também podem ser padronizados para facilitar a adesão de certos tipos celulares e para outras finalidades. Após este procedimento, pode-se realizar a incorporação de entradas adicionais, como microfluídica, sondagem celular ou manipulação genética de uma proteína específica, com o objetivo de responder a questões adicionais, tais como: como combinações de estímulos afetam o comportamento celular individual e de ordem superior?