Name: Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a técnica de litografia por plasma para criar microambientes celulares controlados. Este método permite estudar comportamentos individuais e em grupo de células em dimensões micro e nanométricas.

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<p class="jove_content"&gt; Agradecemos DD Zhang para discussão perspicaz e generosamente fornecer reagentes. MJ é suportado pelo NIH Cardiovascular Training Grant, o Arizona Technology Fund Research Initiative, e Recompensas da realização para cientistas College. Este trabalho é suportado pelo Prêmio de Diretor do NIH Innovator Novo (1DP2OD007161-01), a National Science Foundation (0.855.890), eo James S. McDonnell Foundation.</p

1. Criação de moldes usados ​​para modelar <ol><li> Projeto conceitual de padrões. Padrões são criados que servem para formar redes de celular, entre em contato célula de controle, isolar as células, imitam estruturas naturais, ou guia de adesão celular e posicionamento. </li><li> Computer-aided design ou criação de CAD baseado em padrões e criação de fotomáscara. O padrão desejado é projetado em software CAD, como AutoCAD, e é então enviado para uma empresa de fora para produzir uma fotomáscara. </li><li> Fotolitografia para produzir modelo mestre. Lâminas de vidro são padronizados com qualquer um positivo fina resistir ou um negativo de espessura resistir dependendo do tamanho da estrutura que está sendo criado. Lâminas de vidro são usados ​​para os benefícios de ser de baixo custo, mais forte do que wafers de silício e não produzir poeira tanto quando quebrado. Alternativamente, outras estruturas convenientes, tais como redes de difração pode ser usado como o padrão de mestre. </li><li> O slide padrão está ligado a uma pilha de slides que não tenham sido estampados. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capela de fluxo limpo para minimizar a poeira. </li><li> Criação de moldes de mestre. Um recipiente de papel alumínio um pouco maior que a pilha de slides é criada para manter a 30 g de PDMS (polidimetilsiloxano) que é então derramado sobre a superfície photolithographically padronizada para criar um molde inicial. O PDMS é desgaseificados e permitiu a cura para 1-2 dias. </li><li> Uma vez curado, o PDMS é retirado do padrão de mestre e forma um molde para a próxima etapa. </li><li> 6 g de 2 epóxi parte (Devcon # 14310 (6 g) é misturado por 1 minuto e então derramada no molde mestre, desgaseificados e permitiu a cura. Desgaseificação o epóxi deve ser feito rapidamente (&lt;8 min) usando bolha muitos quebrando ciclos e usando apenas uma fina camada antes que os conjuntos de epoxy e remoção de bolhas torna-se impossível remover as bolhas. O g 6 utilizado produz uma fina camada que facilita a remoção de bolhas rápido. </li><li> Após uma hora, o epóxi parte 2 será parcialmente curado e mais epóxi podem ser adicionados no topo sem desgaseificação para produzir uma estrutura que é mais grosso easer para lidar em etapas posteriores. O epoxy é, então, autorizado a cura para 1-2 dias. </li><li> Uma vez curado, o epóxi é removido do molde mestre PDMS e fita é enrolada em torno do molde de epóxi para formar um recipiente. Um molde de trabalho é então criada por vazamento PDMS no molde de epóxi, desgaseificação do PDMS, e cura de 1-2 dias. </li><li> Uma vez curado, o molde de trabalho é arrancado do epoxy e armazenados para manter a limpeza. </li></ol> 2. Padronização de superfícies com moldes para a orientação das células <ol><li> Pequenas seções do molde de trabalho são cortadas e colocadas em uma placa de Petri de poliestireno. As localizações dessas seções do molde são rotulados. </li><li> Um tripé é formado a partir das seções pequenas e ponderado para garantir o contato entre o molde conformal de trabalho e a superfície da placa de Petri. Boa colocação pode ser observada olhando para o fundo do prato. </li><li> O conjunto é colocado dentro da câmara de plasma. Tratamento de plasma é iniciado e continuado a 150 Pa em 29,6 W (potência máxima) por 10 minutos, com ar plasma. </li><li> Após o tratamento de plasma, o molde e acusação de peso são removidos. </li><li> Placa de Petri é colocado sob luz UV por 10 minutos de esterilização dentro da cabine de segurança biológica e armazenado lá até semeadas com células. </li></ol> 3. Semeadura superfícies com células <ol><li> Células SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma Humano ou outros são cultivadas utilizando protocolos padrão para o tipo de célula. </li><li> Confluência dos SH-SY5Y CRL-2266 células Neuroblastoma Humano é medido visualmente antes da semeadura sobre a superfície modelada. </li><li> Divisão celular normal é realizada para remover as células da superfície da sua placa de Petri. </li><li> As células, flutuando uma vez livre, são semeados sobre a superfície da placa de Petri padronizada depois de ser diluída para atingir a confluência desejada, quando colocado na superfície padronizada. </li><li> As células são autorizados a instalar e anexar à superfície. </li><li> O padrão de Petri é incubada por várias horas a vários dias enquanto as células para montar o padrão criado pelo plasma. </li><li> Quando a cultura de células do neuroblastoma, o ácido retinóico (10 mM) é adicionados diariamente a fim de induzir as células a se diferenciar em um estado neurônio-like. A adição do ácido retinóico é feito no escuro. </li><li> O ácido retinóico é adicionados diariamente por vários dias, após o que a diferenciação será observável. </li><li> Media é substituído a cada 3-4 dias. </li></ol> 4. Observação e Análise <ol><li> Imagens periódica das células vivas ou vídeos são tomadas a fim de observar o comportamento das células ao longo do tempo. Para imagens ao vivo, as células são colocadas em uma incubadora microscópio estágio superior que mantém as células a 37 ° C, umidade de 100%, e 5% CO 2. As células podem também ser fixados e corados para observação sob fluorescência </li><li as imagens ou v das c que foram capturados s importados para um sistema de an imagem e medi realizadas incluindo taxa crescimento tamanho da a velocidade migra diferencia o alinhamento localiza prote espec outros.></ol> 5. Resultados representativos: Um resultado típico da aplicação da técnica de litografia de plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a uma estrutura arbitrária ou natural. Isto é visto na Figura 1a-b onde as linhas e redes de neurônios foram criados. Outros tipos de células podem ser usadas, assim como visto na Figura 1c-d, o que mostra células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e C2C12 células do músculo esquelético formando grades. Materiais, tais como poli-l-lisina também pode ser modelado, Figura 1e para facilitar a fixação de certos tipos celulares e para outros usos. No caso dos neurônios mostrado, o que foi criado são redes de células que possuem conexões entre eles. Esta replica o que ocorre naturalmente no cérebro onde os neurônios têm ligações discretas entre células vizinhas que influencia o funcionamento do cérebro. Com a criação de uma estrutura deste tipo no laboratório, o número, posição, freqüência e outros fatores das ligações podem ser sistematicamente controlados. O resultado dessas arraignments pode ser medida visualmente e insumos adicionais, tais como produtos químicos ou estimulação elétrica pode ser implementada para investigar o comportamento da rede. Um resultado negativo seria um padrão overgrown ou incompletos uma amostra contaminada. Um padrão incompleto ou overgrown resultaria de semeadura o substrato ou com células muito poucos ou muitos que não iria fornecer o padrão com uma quantidade ideal de células. Além disso, se o padrão não foi projetada corretamente (por exemplo, linhas muito estreito) as células não será capaz de unir e crescer com sucesso nele. No caso de uma amostra contaminada, limpeza adequada não teria sido mantida durante uma das etapas que isso é raro quando na sequência de protocolo de cultura celular adequada devido ao fato de que a padronização plasma também esteriliza o substrato. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Padronização de células e proteínas.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de investigação de células aqui apresentada permite a criação de padrões complexos de redes multicelulares que imitam estruturas biológicas, bem como fornece um método para produzir estímulos que são subcelulares na natureza que, em seguida, facilita as investigações de ambos o comportamento das células agrupadas e respostas única célula a fatores ambientais. O uso deste método é simples, mas robusto, pois ele pode ser rapidamente realizados com equipamentos de baixo custo no mesmo laboratório como a cultura de células. É também fortemente células sensíveis, permite fácil observação do comportamento resultante e é por natureza estável por longos períodos de tempo, o que permite investigação do comportamento das células a longo prazo. Além disso, também permite uma gama diversificada de experimentos a serem realizados, uma vez que é compatível com muitos tipos de células e pode criar padrões arbitrários. A estabilidade a longo prazo da técnica deriva do fato de que a funcionalização da superfície transmitida pelo plasma é parte da superfície e não é um revestimento ou outra camada, que podem ser removidos ou degradados. Se mantida sob líquidos, este tipo de modificação pode manter a sua capacidade de orientação para celular meses. A parte mais crítica da experiência necessárias para garantir resultados significativos é a de criar o modelo mestre que acabará por ser usado para a orientação das células. Se esse padrão não é adequadamente projetado, as células não respondem adequadamente ao padrão e não pode produzir um comportamento útil. Parâmetros como largura de linha, espaçamento padrão, e outros podem influenciar bastante a compatibilidade célula com um determinado padrão e, normalmente, uma série de parâmetros como pode ser criado no fotomáscara inicial para a tela para o projeto mais adequado. Outros parâmetros importantes relacionados com a realização de padrões incluem a criação de moldes, manutenção de um ambiente livre de poeira, a semeadura de células e esterilidade geral de cultura de células. Criação de moldes pode ser efectuada pelas etapas de transferência de vários que são realizadas para permitir repetidas PDMS elenco fora de um molde de epóxi. O molde de epóxi é criada porque ela não irá degradar da mesma forma como resistir molde com pequenas estruturas de aspecto alta relação de fundição sob repetidos. Se a moldagem de transferência é feito corretamente, as dimensões eo rendimento não será afetado, mas se for feito de forma incorreta, como por mal de desgaseificação de cura, incompletas ou aquecimento excessivo, bolhas de aspereza, e deformação de um padrão pode ocorrer que afeta o resultado final. Em relação à manutenção de um ambiente livre de poeira, os moldes devem ser mantidas o mais limpo possível, pois a poeira pode interferir com o contato adequado entre o molde PDMS de trabalho e da superfície e, portanto, adequada blindagem plasma e padronização de produtos químicos. A densidade de semeadura das células também devem ser otimizados para garantir que nem as células muito poucos ou muitos habitam a área padrão e esterilidade deve ser mantida para evitar a contaminação bacteriana e outras das células sendo usado. A técnica também pode ser incorporado com outros elementos, como a microfluídica, microeletrodos e sondas mecânicas. Isto proporciona estímulos adicionais para as células, a fim de melhor reproduzir várias condições fisiológicas durante a experimentação e os trabalhos futuros está focada em estudar os efeitos dessas combinações

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner e câmara de vácuo </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência invertido e microscópio de contraste de fase </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio estágio superior incubadora </td><td> AmScope </td><td> Modelo TCS-100 </td><td> Modificado para incluir um gabinete que fornece uma atmosfera apropriada </td></tr><tr><td> Prato de Petri de poliestireno </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS (polidimetilsiloxano) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epóxi </td><td> Devcon </td><td> 2 epoxy ton clara # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura da mídia celular </td><td> Vários </td><td></td><td> Mídia segue formulações padrão para tipo de célula </td></tr><tr><td> Ácido retinóico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

padronização de plasma de superfície litografia para a criação de redes de celular

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Manipulação sistemática de um microambiente celular com resolução de micro e nanoescala é muitas vezes necessária para decifrar vários fenômenos celulares e moleculares. Para atender a esse requisito, temos desenvolvido uma técnica de litografia plasma para manipular o microambiente celular, criando uma superfície modelada com tamanhos recurso que variam de 100 nm para milímetros. O objetivo desta técnica é ser capaz de estudar, de forma controlada, o comportamento de células individuais, bem como grupos de células e suas interações. Este método de litografia de plasma é baseado na modificação seletiva da química de superfície sobre um substrato por meio de proteger o contato de plasma de baixa temperatura com um molde físico. Esta blindagem seletiva deixa um padrão químico que pode guiá-adesão celular e movimento. Este padrão, ou modelo de superfície, pode então ser usado para criar redes de células cuja estrutura pode imitar aquela encontrada na natureza e produz um ambiente controlável para investigações experimentais. A técnica é bem adequado para estudar fenômeno biológico, uma vez que produz padrões de superfície estável em substratos poliméricos transparentes de forma biocompatíveis. Os padrões de superfície durar de semanas a meses e pode, assim, orientar a interação com as células por longos períodos o que facilita o estudo de longo prazo processos celulares, como diferenciação e adaptação. A modificação da superfície é principalmente de natureza química e, portanto, não apresenta interferência topográfica ou física para a interpretação dos resultados. Ele também não envolve quaisquer substâncias duras ou tóxicas para a alcançar padrões e é compatível para cultura de tecidos. Além disso, ele pode ser aplicado para modificar vários tipos de substratos poliméricos, que devido à capacidade de ajustar as suas propriedades são ideais para e são amplamente utilizados em aplicações biológicas. A resolução alcançável também é benéfico, como o isolamento dos processos específicos, tais como a migração, adesão ou ligação permite discretos, observações claro no único nível multicell. Este método tem sido empregado para formar diversas redes de diferentes tipos de células para as investigações envolvendo a migração, sinalização, formação de tecido, eo comportamento e as interações de neurônios acusado em uma rede.

A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

A manipulação sistemática de um microambiente celular com resolução micro e nanométrica é frequentemente necessária para decifrar diversos processos celulares e moleculares...

O objetivo geral do experimento a seguir é criar microambientes celulares para estudar questões biológicas relacionadas a comportamentos celulares individuais e coletivos que ocorrem em dimensões micro e nanométricas. Isso é alcançado primeiramente projetando modelos que, em última instância, orientarão o posicionamento celular. Em seguida, esses projetos são transformados em superfícies padronizadas por meio da fotolitografia, o que permite a criação de moldes de blindagem de plasma por litografia macia.Por fim, esses moldes de blindagem são dispostos como um tripé em uma placa de Petri para permitir a exposição seletiva das superfícies subjacentes ao plasma, o que deixará um padrão químico sensível a células nas áreas sob cada molde. Os resultados podem demonstrar como o comportamento de uma célula depende do seu microambiente e de sua interação com células vizinhas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre os efeitos dos microambientes no comportamento celular, como, por exemplo, como as interações entre grupos de células afetam fenômenos de ordem superior?E como as pistas nanométricas subcelulares afetam funções como migração celular e diferenciação? Primeiro, use cola super forte para fixar uma lâmina com padrão a uma pilha de lâminas em branco. Em seguida, crie um recipiente de folha de alumínio ligeiramente maior que a pilha de lâminas e grande o suficiente para conter 30 gramas de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS.Coloque a pilha de lâminas no recipiente e, em seguida, despeje o PDMS sobre a pilha de lâminas para criar uma matriz inicial. Em seguida, remova o ar do PDMS colocando o recipiente dentro de uma câmara de vácuo. Quebre as bolhas presentes no PDMS removendo e substituindo rapidamente um dedo sobre a tubulação da válvula de entrada várias vezes, permitindo brevemente que o ar entre na câmara.A válvula permanece fechada durante cinco minutos de dessorção ininterrupta. Em seguida, deixe a PDMS curar na câmara de fluxo limpo à temperatura ambiente por um a dois dias. Após o endurecimento, a PDMS é destacada do molde mestre, formando um molde.Em seguida, despeje uma camada fina de seis gramas de resina epóxi de duas partes, recém-misturada por um minuto, dentro da matriz principal. Desgaseifique imediatamente a resina epóxi utilizando vários ciclos de rompimento de bolhas antes que a resina endureça. Após a resina desgaseificada permanecer em repouso, sem perturbação, por uma hora, ela estará parcialmente curada.Adicione mais epóxi ao molde sem dessorver para produzir uma estrutura mais espessa, que será mais fácil de manipular nas etapas posteriores. Em seguida, deixe o epóxi curar por um a dois dias. Após o epóxi ter curado, remova-o do molde mestre de PDMS e, então, enrole fita ao redor do molde de epóxi para formar um recipiente.Uma matriz de trabalho pode então ser criada despejando PDMS sobre a matriz de epóxi, desgaseificando o PDMS e curando a nova matriz por um a dois dias. Após a cura da matriz de trabalho, desprenda a matriz do epóxi e armazene ambas dentro de placas de Petri em um recipiente plástico fechado dentro da câmara de fluxo laminar para manter a limpeza. Para preparar uma matriz para padronização de superfície, corte pequenas seções da matriz de trabalho com uma lâmina de barbear e coloque as seções em uma placa de Petri.Os locais dessas seções de molde são etiquetados no verso da placa de Petri com uma caneta permanente, fazendo um contorno ao redor das seções de molde, formando um tripé a partir das seções e aguardando o tripé para garantir o contato conformal entre o molde ativo e a superfície da placa de Petri. Observe a parte inferior da placa para confirmar a boa colocação, evidenciada pela presença de canais visíveis a olho nu ou com uma pequena lente de aumento. Coloque o conjunto em uma câmara de plasma.Inicie o tratamento com plasma após o tratamento com plasma. Remova o molde e a disposição de pesos e coloque a placa de Petri dentro de uma cabine de segurança biológica sob luz UV por 10 minutos para esterilização. Armazene a placa nesse local até que seja semada com células.Dilua as células experimentais de escolha em seu meio de cultura padrão para atingir a confluência desejada. Quando colocadas sobre a superfície do disco de Petri padronizado, despeje três mililitros da solução celular no disco de Petri. Incube o disco de Petri padronizado a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, umidade de 100% por várias horas a vários dias para permitir que as células se organizem no padrão criado pela célula de plasma.A padronização é verificada por microscopia de contraste de fase. Ao cultivar células de neuroblastoma, adicione 10 micromolares de ácido retinóico diariamente até que a diferenciação celular em um estado semelhante ao de neurônio seja observada. Substitua o meio de cultura celular padrão a cada três ou quatro dias.Um resultado típico da implementação da técnica de litografia por plasma é a formação de um padrão de células que se assemelha a alguma estrutura arbitrária ou natural. Um exemplo disso pode ser visto nesta figura, com neurônios que foram diferenciados com ácido retinóico sobre um padrão de linhas. E aqui nesta figura, onde foram criadas linhas e redes de neurônios. Outros tipos celulares além dos neurônios também podem ser utilizados, conforme mostrado nas próximas duas figuras; esta figura mostra células endoteliais de veia umbilical humana, e esta figura mostra células musculares esqueléticas C2C12 formando grades, como visto aqui.Materiais como polilisina também podem ser padronizados para facilitar a adesão de certos tipos celulares e para outras finalidades. Após este procedimento, pode-se realizar a incorporação de entradas adicionais, como microfluídica, sondagem celular ou manipulação genética de proteínas específicas, com o objetivo de responder perguntas complementares, tais como: como combinações de estímulos afetam o comportamento celular individual e de ordem superior?

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Este protocolo introduz um método de micropadronização livre de litografia que é simples e acessível para aqueles com um fundo de bioengenharia limitado. Este método utiliza estêncil personalizado de corte a laser para micropadrão proteínas de matriz extracelular em uma forma de interesse para modulação de morfologias celulares. O procedimento de micropadronização é demonstrado usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

O protocolo aqui apresentado permite a fabricação automatizada de micropatterns que padronizam a forma celular para estudar estruturas citoesquelletais dentro de células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar pode ser configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente e não requer equipamentos especializados inacessíveis aos laboratórios de biologia celular padrão.

Controle da Geometria Celular através de Micropatterning Assistido por Laser Infravermelho

Tradicionalmente, a cultura celular é realizada em substratos planares que imitam mal o ambiente natural das células in vivo. Aqui descrevemos um método para produzir substratos de cultura celular com geometrias curvas fisiologicamente relevantes e proteínas extracelulares micropatteradas, permitindo investigações sistemáticas sobre o sensoriamento celular dessas pistas extracelulares.

Geração de Microambientes Celulares Multicue por UV-Fotopatterning de Substratos de Cultura Celular Tridimensional

Aprenda a técnica de litografia por plasma para criar microambientes celulares controlados. Este método permite estudar comportamentos individuais e em grupo de células em dimensões micro e nanométricas.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

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