Isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos embrionários primários do mesencéfalo de camundongos

Pegue o tecido do assoalho do mesencéfalo isolado da região ventral do mesencéfalo de embriões de camundongos.

O tecido é rico em neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento, que liberam o neurotransmissor dopamina.

Adicione uma solução enzimática para quebrar a matriz do tecido, soltando assim as células.

Adicione uma solução de soro contendo DNase I e dissocie mecanicamente o tecido digerido para gerar uma suspensão celular. As proteínas séricas inibem as enzimas, enquanto a DNase I degrada o DNA extracelular liberado durante a lise celular, impedindo a aglomeração celular.

Deixe os detritos do tecido assentarem e transfira as células suspensas para um novo tubo.

Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em um meio neuronal de dopamina, ou DPM.

Pegue uma microplaca revestida com um substrato de cultura de células no centro dos poços, criando micro-ilhas.

Transfira as células para o meio das micro-ilhas para cultivá-las em alta densidade.

Incubar, permitindo que as células adiram às micro-ilhas.

Encha os poços com DPM e incuba, facilitando o crescimento dos neurônios dopaminérgicos.

Para configurar culturas primárias de mesencéfalo embrionário a partir de embriões de camundongos embrionários de camundongo no dia 13,5, agrupe todos os assoalhos do mesencéfalo colhidos no mesmo tubo de 1,5 mililitro e lave as amostras três vezes, com 500 microlitros de HBSS livre de cálcio e magnésio por lavagem. Após a última lavagem, substitua o HBSS por 0,5% de tripsina para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, adicione 500 microlitros de uma solução de DNase I recém-preparada em solução de FBS ao tecido parcialmente digerido e use uma pipeta de vidro siliconizada com uma ponta polida a fogo para triturar o tecido. Quando apenas partículas minúsculas e pouco visíveis puderem ser observadas, permita que esses fragmentos de tecido se depositem no fundo do tubo da microcentrífuga e transfira o sobrenadante para um tubo cônico de polipropileno vazio de 15 mililitros.

Adicione um mililitro de HBSS ao tubo contendo DNase I em FBS e misture várias vezes por pipetagem. Transfira um mililitro desta solução para as partículas de tecido restantes e triture as amostras novamente. Em seguida, agrupar a suspensão celular digerida com o tubo de sobrenadante sem transferir quaisquer fragmentos de tecido restantes. Depois de triturar a amostra de tecido mais uma vez com a DNase I restante em FBS em HBS, sedimentar as células coletadas por centrifugação e aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet.

Lave as células duas vezes em dois mililitros de meio neuronal dopaminérgico aquecido por lavagem e ressuspenda as células a 3 x 10⁴ células por seis microlitros de concentração de meio fresco e quente em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, remova o meio de cada micro-ilha previamente preparada e misture as células com pipetagem suave antes de usar uma pipeta de 10 microlitros para adicionar seis microlitros de células a cada micro-ilha.

Quando todas as células tiverem sido adicionadas, encha os poços vazios nas bordas da placa com 150 microlitros de água ou PBS e coloque a placa na incubadora de cultura de células por uma hora. No final da incubação, adicione 100 microlitros de meio neurônio dopaminérgico fresco a cada poço e retorne a placa à incubadora.