Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas em Células Progenitoras Neurais

Pegue uma microplaca contendo uma cultura aderente de fibroblastos embrionários de camundongo, ou MEFs, em um meio.

Os MEFs aderidos funcionam como uma camada alimentadora, fornecendo um microambiente de cultura celular de suporte.

Remova o meio e introduza células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou hiPSCs, em um meio hiPSC suplementado com pequenas moléculas que aumentam a sobrevivência celular.

Incube para permitir que os hiPSCs adiram à camada alimentadora, que secreta fatores de crescimento que facilitam a proliferação de hiPSCs.

Remova o meio e adicione uma solução enzimática para separar as células. Transferir as células e centrifugá-las, retirar o sobrenadante e ressuspendê-las no meio hiPSC.

Transfira as células para uma placa revestida de biopolímero. Incubar para permitir que os MEFs adiram.

Transfira os hiPSCs suspensos para uma microplaca de fundo em V. Centrifugue as células e incuba-as, induzindo a formação de agregados celulares.

Reabasteça com um meio de diferenciação. Os nutrientes do meio e as interações célula-célula dentro do agregado facilitam a diferenciação de hiPSC em células progenitoras neurais.

Para este protocolo, comece estabelecendo células alimentadoras. Para estabelecer essa cultura, coloque 600.000 células alimentadoras em cada poço de uma placa de seis poços, com 300 mililitros de meio por poço. Depois de cultivar as células alimentadoras por 48 horas, substitua o meio e incube as placas por uma hora, enquanto prepara as células-tronco.

Descongele as células-tronco em banho-maria a 37 graus Celsius. Depois de descongeladas, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e encha o tubo até 5 mililitros com meio de cultura, adicionado gota a gota. Em seguida, centrifugue suavemente as células por quatro minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 1 mililitro de meio de células-tronco com inibidor de ROCK.

Depois de quantificar a densidade celular, coloque 300.000 células-tronco nas células alimentadoras. Em seguida, cresça e expanda as culturas, selecionando periodicamente células saudáveis. Após a expansão e congelamento das células para backup, cultive as colônias de células-tronco em placas padrão até que atinjam 50% a 70% de confluência.

Em seguida, use um tratamento enzimático suave e uma titulação suave com uma ponta de pipeta de 1 mililitro para colher as HIPSCs para diferenciação de células precursoras neurais. Centrifugue suavemente a suspensão, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio iPSC humano de 5 mililitros. Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa de cultura de células de 5 centímetros revestida com gelatina a 0,1% e incube a placa por uma hora.

Após uma hora, transfira as células não aderentes para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, enxágue suavemente a placa com 3 mililitros de meio e transfira-a para o mesmo tubo. Em seguida, repita a etapa de ressuspensão com centrifugação suave.

Em seguida, determine a densidade celular e coloque as células em uma placa de fundo em V de 96 poços e baixa adesão a 9.000 células por poço. Agora, gire a placa por três minutos e comece a cultivar as células. Nos próximos 14 dias, em dias alternados, substitua metade do meio por um meio de diferenciação novo.