Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:05 min. • July 8th, 2025
Coloque uma retina de camundongo de montagem plana em uma solução fisiológica dentro de uma câmara de gravação.
Usando um microscópio, posicione uma pipeta de registro acima da retina. A pipeta contém um eletrodo e é preenchida com uma solução interna.
Aplique pressão positiva para evitar o entupimento da pipeta, insira-a na retina e reduza a pressão para evitar danos aos tecidos.
Avance a pipeta em direção às células amácrinas starburst, ou SACs, que estão sinapticamente ligadas a outros neurônios.
Aproxime-se de uma célula até que uma covinha se forme em sua membrana. Libere a pressão, permitindo que a membrana adira à ponta.
Use uma corrente negativa para puxar um adesivo de membrana para dentro da pipeta.
Aplique sucção para romper a membrana, estabelecendo continuidade entre o eletrodo e o citoplasma da célula, uma técnica chamada patch-clamp de célula inteira.
Para registrar as correntes sinápticas, aplique uma tensão para manter o potencial de membrana do SAC constante.
Os neurotransmissores liberados por neurônios ligados sinapticamente desencadeiam o fluxo de íons através dos receptores sinápticos SAC, medidos pelo eletrodo.
Neste procedimento, filtre a solução interna através de um filtro de seringa no filamento de preenchimento personalizado. Em seguida, insira o filamento em uma micropipeta recém-puxada e dispense a solução interna perto da ponta até que a solução cubra o fio do eletrodo de prata por mais de 5 milímetros. Em seguida, prenda a micropipeta em um porta-eletrodo com uma haste de sucção, através da qual a pressão dentro do eletrodo pode ser ajustada empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa de plástico de 10 mililitros conectada a um tubo.
Em seguida, localize a pipeta sob a objetiva e abaixe-a a cerca de 100 micrômetros acima da retina. No modo seguidor de corrente, use o deslocamento CC para zerar o sinal de tensão CC permanente. Meça a resistência da pipeta no modo de pinça de corrente injetando correntes de onda quadrada de amplitude fixa através da pipeta enquanto ela está no banho. Neutralize a diferença girando o botão de acesso R e use a leitura nele para calcular a resistência da pipeta.
Depois disso, leve lentamente o eletrodo a cerca de 10 micrômetros acima da retina. Aplique pressão positiva ao eletrodo. Em seguida, observe a mudança de reflexão para a ponta da pipeta à medida que se aproxima da retina.
Forçar rápida mas suavemente a pipeta para dentro do GCL e reduzir imediatamente a pressão positiva. Mova a pipeta em direção a um neurônio marcado e evite entrar em contato com outros neurônios, vasos sanguíneos e pés finais das células de Muller. Aplique mais pressão positiva, se necessário, para evitar o entupimento do eletrodo.
Em seguida, posicione a ponta da pipeta perto do neurônio marcado até que uma covinha seja visível. Em seguida, libere a pressão positiva e deixe a membrana plasmática saltar de volta para a ponta da pipeta. Aplique correntes negativas de 20 a 120 amperes pico à pipeta para ajudar na formação de uma vedação de giga-ohm.
Permitir que a membrana celular se recupere após liberar a pressão positiva é importante porque uma excelente vedação formada naturalmente entre a membrana e a abertura da pipeta é importante para preservar a morfologia celular após o registro.
Se necessário, aplique uma sucção suave para puxar a membrana plasmática para dentro da pipeta. Aguarde cinco minutos após a formação do selo para romper a membrana celular para permitir a depuração da solução interna derramada por superfusão. Depois que a membrana for rompida, e enquanto estiver no atual clamp modo, ligue o equilíbrio da ponte e ajuste-o usando o botão do eixo R. Registre as correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias no modo de pinça de tensão, mantendo a célula em potenciais de reversão.