A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated
22 de setembro de 2011
Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.
Este procedimento usa ratos sensíveis ao sal e resistentes ao sal para comparar a reatividade das artérias de resistência mesentérica sob tensão de fenilefrina ao cálcio extracelular. Isso é feito isolando primeiro a arcada mesentérica dos animais e dissecando os ramos da artéria de resistência. Próximo. O primeiro dos dois fios de aço inoxidável é enfiado através de um pequeno segmento da artéria dissecada e o vaso é montado na câmara gráfica.
Em seguida, o segundo fio de aço inoxidável é enfiado através do lúmen do vaso paralelo ao primeiro fio. Em seguida, o vaso montado é esticado até uma circunferência interna normalizada. A etapa final do procedimento é reativar o vaso, desafiando-o com aplicações repetidas de fenilefrina e relaxando-o com aplicações cumulativas de cálcio.
Em última análise, os resultados mostram mudanças na tensão no vaso, que pode ser convertida em uma curva de resposta de cálcio e usada para determinar os valores de EC 50. Para comparação. Tivemos a ideia de usar esse método pela primeira vez quando descobrimos que a rede nev de baterias maçonárias de ratos expressava um receptor gpro de cobre cálcio sens.
Isso pode ser estudado da mesma forma que os receptores AIC amargos, que são ativados pelo agonista. Geralmente, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque o endotélio e as camadas do músculo liso são pequenos. Os vasos são facilmente danificados.
Se isso ocorrer, as propriedades mecânicas desses vasos podem ser comprometidas. Para começar, prepare a área de trabalho e os instrumentos cirúrgicos. Coloque um animal anestesiado de costas e limpe o abdômen com álcool.
Depois de realizar uma laparotomia na linha média, use uma tesoura para remover cerca de 85 centímetros do intestino, incluindo a artéria mesentérica superior. Corte a extremidade proximal perto do pilori e a extremidade distal perto da junção ileocecal. Colocar a secção excisada numa placa de Petri revestida contendo solução salina fisiológica ou PSS à temperatura ambiente.
Prenda a extremidade proximal do intestino à direita e, em seguida, prenda o restante do intestino no sentido anti-horário. Em seguida, disseque um segmento da artéria mesentérica contendo os ramos dois e três e um pedaço do intestino da extremidade proximal. Identifique o ponto de ramificação em forma de V da artéria mesentérica e disseque-o para longe da veia.
Use uma pinça para afastar suavemente o tecido adiposo e conjuntivo para evitar o contato direto com a artéria. Para começar a montar, o vaso cortou dois segmentos de artéria com cerca de dois milímetros de comprimento. A ponta de um fio de aço inoxidável livre de tungstênio de 40 micrômetros de quatro centímetros pode ser usada para abrir o lúmen da artéria.
Em seguida, use uma pinça fina para inserir o fio no lúmen de cada artéria. Tomando cuidado para não danificar o endotélio, encha a câmara do mioenxerto com PSS a 37 graus Celsius. Use uma pinça para transferir o segmento do vaso rosqueado para a câmara.
Em seguida, transfira o segmento do vaso proximal excisado para a câmara do myógrafo e puxe a extremidade ao longo do fio para alimentá-lo no recipiente. Evite esticar o recipiente. Prenda a extremidade próxima do fio no sentido anti-horário sob o parafuso de fixação próximo na mandíbula direita conectada ao micrômetro.
Pegue a extremidade livre do fio com uma pinça e prenda-a no sentido horário sob o parafuso de fixação distante na mandíbula direita, certifique-se de que o segmento do vaso ao longo do fio esteja situado no espaço entre as garras sem fazer contato com a própria mandíbula. Separe as garras. Alinhe o segundo fio paralelo ao vaso e insira-o na extremidade do lúmen.
Passe suavemente o fio através do lúmen do segmento do vaso em um movimento usando o fio já montado como guia. Segure o fio a cerca de um centímetro do vaso para evitar esticá-lo durante a manobra e evite tocar no endotélio. Aparafuse as garras e certifique-se de que o segundo fio de montagem se mova por baixo do primeiro preso à direita.
A mandíbula prende a extremidade próxima do segundo fio no sentido horário sob o parafuso de fixação próximo da mandíbula esquerda conectada ao transdutor. Prenda a extremidade do fio sob o parafuso de fixação na mandíbula esquerda e aperte para esticar o fio. Quando a montagem estiver concluída, aguarde 30 minutos para o equilíbrio a 37 graus Celsius.
Após o equilíbrio, o motor é reiniciado a partir do menu de montagem e o procedimento de normalização, que estica o vaso para uma circunferência interna normalizada, é iniciado. Para começar, abra o menu de normalização e defina a pressão transmural alvo para 13,3 quilopascais. Em seguida, defina a duração de cada uma das etapas de normalização para 60 segundos.
A relação IC um para IC 100 deve ser igual a 0.9 e a calibração IP deve ser definida para duas estrelas delta. Meça o comprimento da artéria mesentérica montada usando as leituras da ocular do microscópio quando as linhas do cabelo estão sobre o distante e os neurônios do segmento do vaso. Após a normalização, os vasos são reativados realizando uma partida padrão que consiste em uma série de estímulos e períodos de washout.
Primeiro, recoloque a tampa da câmara myo e inicie a aeração com 95% de ar e 5% de dióxido de carbono. Encher a câmara com PSS fresco contendo ácido ascórbico 100 micromolar. Contraia o vaso com cinco micromolares de erva-doce, rine ou PE por cinco minutos e lave quatro vezes com tampão PSS Após a última lavagem, reabasteça a câmara com PSS e aguarde três minutos antes de reabastecer a câmara com PSS e contrair com PE.As mostrado anteriormente, a artéria está pronta para o experimento.
Meça o relaxamento dos vasos contraídos adicionando cumulativamente concentrações crescentes de cloreto de cálcio. Esta tabela mostra que as tensões basais após a aplicação de fenilefrina variaram entre ratos wistar DS ou sensíveis ao sal de boneca e DR ou resistentes ao sal de boneca. Este traço de um rato wistar mostra relaxamento das artérias contraídas por PE por adições cumulativas de relaxamento de cálcio com severamente comprometido nos tecidos de ratos DS em comparação com ratos Wistar e em comparação com Dr.Rats como visto aqui, as diferenças na sensibilidade ao cálcio podem ser vistas nas curvas de resposta ao cálcio e novamente ao calcular os valores de EC 50.
Finalmente, os ratos DS mostram uma redução na expressão do receptor sensor de cálcio nas artérias em comparação com o Dr.Rats Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em duas horas se realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como comparar a reatividade vascular do pequeno átrio entérico com o composto exógeno sob condições isométricas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método automatizado de miografia para medir a força em artérias mesentéricas isoladas. A técnica utiliza um miógrafo automático de dois fios Mulvany-Halpern 510A para avaliar as respostas à fenilefrina e ao cálcio extracelular, permitindo medições consistentes de resposta isométrica em vasos pequenos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Técnicas de Miorrefia
Antecedentes
- As artérias mesentéricas desempenham um papel crucial na regulação do fluxo sanguíneo.
- Compreender sua reatividade é importante para a pesquisa cardiovascular.
- A fenilefrina é um agonista comum usado para estudar respostas vasculares.
- Os níveis de cálcio são críticos para a contração do músculo liso vascular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para medir a força em artérias mesentéricas pequenas.
- Comparar a reatividade de ratos sensíveis ao sal e resistentes ao sal.
- Avaliar os efeitos da fenilefrina e do cálcio sobre as respostas vasculares.
Métodos Utilizados
- Isolamento do arco mesentérico de ratos.
- Dissecação de ramos arteriais de resistência.
- Montagem de artérias em uma câmara de miógrafo utilizando fios de aço inoxidável.
- Aplicação de fenilefrina e cálcio para avaliar a reatividade vascular.
Resultados Principais
- Medições consistentes de força foram obtidas em artérias isoladas.
- Foram observadas diferenças na reatividade entre ratos sensíveis e resistentes ao sal.
- A fenilefrina induziu efetivamente tensão nas artérias.
- A aplicação de cálcio resultou no relaxamento dos vasos.
Conclusões
- O método automatizado de miografia fornece uma abordagem confiável para o estudo das respostas vasculares.
- Essa técnica pode aprimorar a compreensão da função da artéria mesentérica.
- Os achados podem ter implicações para a pesquisa de doenças cardiovasculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A miografia automatizada com fios de artérias mesentéricas permite uma avaliação precisa e quantitativa da reatividade vascular sob condições isométricas, apoiando a validação precoce de alvos na pesquisa cardiovascular. Esta abordagem fornece confiança preditiva para a redução de riscos mecanicistas de alvos vasculares e orienta decisões de portfólio em programas de hipertensão e disfunção vascular. A reprodutibilidade do método e suas saídas quantitativas facilitam a comparação robusta dos efeitos de compostos e modelos genéticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função de receptores e das vias de sinalização do músculo liso vascular.
- Apóia a desmistificação biológica ao quantificar as respostas contráteis e de relaxamento a agonistas e antagonistas.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de alvos para indicações vasculares e cardiovasculares.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas vasculares validados ex vivo para triagem de compostos e estudos mecanicistas.
- Fornece medidas padronizadas, reprodutíveis e quantitativas de tensão para o desenvolvimento de ensaios.
- Permite comparação paralela de agentes farmacológicos e modelos genéticos em formato escalável.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de reatividade vascular ex vivo com modelos relevantes para a doença de hipertensão e disfunção vascular.
- Apóia a identificação de biomarcadores translacionais ao associar a expressão de receptores com resultados funcionais.
- Oferece continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica de alvos vasculares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método automatizado de miografia se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando estudos mecanicistas iniciais com pesquisas translacionais em biologia vascular.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a contratilidade e o relaxamento dos vasos para testar hipóteses sobre a função de receptores e sinalização.
- Triagem: Fornece preparações de vasos prontas para ensaios e reprodutíveis para avaliação de compostos e classificação de potência.
- Análises: Gera valores de CE50 e curvas de resposta para comparação estatística robusta entre condições e modelos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona dados funcionais ex vivo com modelos de doenças in vivo e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada para investigação contínua de alvos e vias vasculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos vasculares.
- Valor Operacional: Fornece ensaios padronizados, reprodutíveis e escalonáveis de reatividade vascular.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar e reduz riscos biológicos em fases tardias nos portfólios cardiovasculares.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos vasculares e compostos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação vascular e manipulação de tecidos ex vivo.
- Necessita de acesso a instrumentação automatizada de miografia com fio e software analítico.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos procedimentos de montagem e normalização dos vasos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes tipos de vasos ou modelos de doenças.
- O pequeno tamanho dos vasos aumenta o risco de danos mecânicos, afetando a confiabilidade do ensaio.
