Determinando um efeito de teste do hormônio do crescimento nos neurônios da kisspeptina usando um grampo de remendo de células inteiras

Fixe uma fatia hipotalâmica de camundongo transgênico em uma câmara de registro perfundida com aCSF.

A fatia contém neurônios de kisspeptina que expressam proteínas de fusão fluorescentes, cruciais para a regulação do sistema reprodutivo.

Monte uma micropipeta composta por um eletrodo de registro em uma solução interna.

Localize microscopicamente um neurônio de kisspeptina fluorescente.

Aplique pressão positiva na pipeta e avance-a em direção ao neurônio-alvo. Ao entrar em contato, a pressão cria um recuo na membrana neuronal.

Aplique uma breve pressão negativa, formando uma vedação de alta resistência entre a micropipeta e a membrana.

Defina a tensão de retenção no potencial fisiológico de repouso do neurônio para medições precisas.

Aplique breves pulsos de pressão negativa para romper a membrana, estabelecendo uma configuração de célula inteira.

Confirme a viabilidade do neurônio monitorando os parâmetros.

Introduza um hormônio do crescimento de teste, desencadeando vias de sinalização e induzindo mudanças no potencial de membrana do neurônio.

Meça as mudanças no potencial de membrana para determinar o efeito inibitório do hormônio do crescimento na atividade neuronal.

Transfira uma fatia de cérebro de interesse, uma de cada vez, para a câmara de gravação usando uma pipeta de transferência de acrílico. Segure o corte com uma âncora de corte para que ele não se mova durante a perfusão do aCSF. Posicione a fatia no centro da câmara de registro usando a lente objetiva de baixa potência do microscópio de imersão 10x ou 20x.

A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada sob o microscópio e para um alcance perfeito para a micropipeta de registro. Depois de localizar a região de interesse, troque a lente objetiva para a lente de alta potência, 63x, e concentre-se no nível do tecido, observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células de kisspeptina na superfície da fatia do cérebro.

Quando uma possível célula de destino for localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato como um quadrado sobre a área de interesse. A tela do computador marcada ajuda a guiar a posição da micropipeta de gravação até a célula. Depois de determinar a localização exata da célula-alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de registro preenchida com a solução interna no porta-eletrodos, garantindo que a solução interna esteja em contato com o eletrodo de prata.

Aplique uma pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF usando uma seringa cheia de ar de 1 a 3 mililitros conectada ao porta-micropipeta por meio de um tubo de polietileno para evitar que detritos entrem na micropipeta. Usando o micromanipulador, guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar os eixos x, y e z da micropipeta em direção à célula de interesse.

Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta até o plano de foco, garantindo que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desça lentamente até tocar a superfície da célula ou a região alvo.

Aplicando uma leve pressão positiva com a seringa cheia de ar de 1 a 3 mililitros para limpar quaisquer detritos do caminho de aproximação, mova lentamente o micromanipulador nos eixos x, y, z para aproximar a ponta da micropipeta e tocar a célula-alvo, o que causa uma covinha pela pressão aplicada. Depois de estabelecer a covinha, com a ajuda do voltage clamp modo no software, aplique uma sucção breve fraca por via oral por 1 a 2 segundos através do tubo conectado ao suporte da micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta e a célula.

Se a vedação permanecer mecanicamente estável sem interferência de ruído por cerca de um minuto, ajuste a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse. Para neurônios hipotalâmicos de kisspeptina, recomenda-se menos 50 milivolts. Em seguida, aplique uma breve sucção por via oral para quebrar a membrana plasmática na ponta da micropipeta selada colocada na célula para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta ou atraia uma porção considerável da membrana ou da célula.

Uma configuração adequada de toda a célula pode ser alcançada realizando a sucção com força suficiente. Verifique o manual de configurações do sistema usado. Depois de quebrar a membrana celular, ative a opção Célula inteira no modo de grampo de tensão e clique no comando automático referindo-se à guia Célula inteira.

Em seguida, verifique os parâmetros de viabilidade celular no software, conforme descrito no manuscrito do texto. Monitore a resistência da série e a capacitância do estado estacionário das células durante os experimentos. Uma vez que a configuração de toda a célula seja alcançada corretamente, meça as correntes sinápticas no modo de pinça de tensão. Registre as mudanças no potencial de membrana em repouso e as variações do potencial de membrana em repouso induzido no modo de pinça de corrente.