Respostas pós-sinápticas evocadas por luz em neurônios de fatias de retina de camundongos

Pegue uma fatia de retina de camundongo adaptada ao escuro dentro de uma câmara de gravação em uma sala escura. A retina fica em uma base artificial de suporte colocada sobre uma lamínula. Perfunda a fatia com aCSF.

A rede neural da retina inclui fotorreceptores sinapticamente ligados a células bipolares que fazem sinapses com células ganglionares.

Posicione uma pipeta de gravação perto da retina.

Sob um microscópio, aplique pressão positiva ao se aproximar de uma célula ganglionar alvo.

Mude para pressão negativa para puxar um adesivo de membrana e, em seguida, rompa-o para estabelecer continuidade com o citoplasma.

No escuro, a membrana do fotorreceptor permanece despolarizada, levando à liberação do neurotransmissor.

Os neurotransmissores que se ligam aos receptores de células bipolares desencadeiam o fechamento do canal catiônico, inibindo a transmissão do sinal.

Aplique um pulso de luz para hiperpolarizar os fotorreceptores. A diminuição da liberação de neurotransmissores desencadeia a abertura do canal catiônico em células bipolares.

O influxo de cátions induz a liberação de neurotransmissores que se ligam aos receptores das células ganglionares, gerando um potencial pós-sináptico excitatório registrado pela pipeta.

Para gravações de grampo de remendo, prepare os tubos de perfusão com o meio de Ames e permita que todas as bolhas passem do tubo. Depois de fazer pipetas de gravação com um extrator de vidro, preencha a ponta com solução de pipeta. Em seguida, use um enchimento de micropipeta para encher cerca de um terço da pipeta. Depois de cheia, armazene cada pipeta em uma caixa de pipeta úmida.

Em seguida, ligue o equipamento para gravações de patch-clamp, incluindo o computador, amplificador, câmera CCD e microscópio. Trabalhando em condições escuras, coloque uma preparação de fatia de retina na platina do microscópio com a ajuda de um visualizador infravermelho. Depois de imobilizado, inicie a perfusão contínua.

Defina a temperatura de perfusão para 33 a 37 graus Celsius. Visualize a superfície da fatia com uma câmera CCD. Concentre-se no local de destino onde residem os tipos de célula de destino. Selecione uma célula de aparência saudável para gravação de patch-clamp. Assim que uma célula saudável for identificada, coloque uma pipeta de gravação em um porta-pipetas e avance a pipeta para a preparação da fatia.

Quando estiver perto da preparação da fatia, encontre a ponta da pipeta com um microscópio. Quando a ponta da pipeta estiver visível ao microscópio, mova-a para baixo em direção à célula-alvo. Em seguida, ajuste o amplificador e ajuste a pipeta em picoamperes 5 volts por nanoamperes. Inicie dois pulsos elétricos contínuos de aproximadamente 5 milivolts e aproximadamente 10 hertz e verifique a resistência da pipeta.

Uma resistência ideal é entre 5 e 12 megaohms para a maioria dos neurônios da retina. Quando estiver pronto, use um bocal ou seringa para soprar a solução interna, até que a ponta da pipeta esteja na superfície da célula-alvo. Quando a pressão positiva fizer uma pequena covinha na superfície da célula, avance ligeiramente a ponta e pare de soprar.

Se a resistência da pipeta estiver aumentando continuamente, deixe-a e monitore a resistência até atingir mais de 1 gigaohm. Se a resistência não aumentar espontaneamente, aplique suavemente pressão negativa até que se torne um gigaseal. Depois que o gigaseal for alcançado, altere o potencial de retenção para 70 milivolts negativos.

Em seguida, aplique pressão negativa intermitentemente para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando a configuração de toda a célula é feita, a resistência da pipeta pode estar entre 500 megaohms e um gigaohm, e a corrente capacitiva é observável. Registre a relação IV de menos 80 a 40 milivolts. Diferentes tipos de canais dependentes de tensão serão ativados dependendo do tipo de célula. Por fim, registre correntes ou tensões sinápticas evocadas por luz.