Name: A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a administrar antagonistas muscarínicos subcutaneamente no músculo LAL de camundongos adultos e realizar imunocoloração tripla para visualizar alterações morfológicas nas junções neuromusculares. Este método permite estudar o papel dos receptores muscarínicos na integridade das JNMs.

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Este trabalho foi financiado pela Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320).

1. Administração subcutânea de acetilcolina muscarínicos receptor (mAChR) antagonistas <ol><li> Prepare sob condições assépticas, a dose apropriada de antagonista mAChR, (cf., Tabela) pela dissolução da droga no soro fisiológico estéril, em tubo de reação 1,5 ml. Os antagonistas foram utilizados os seguintes: atropina, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Desenhe 50μl de solução em seringa de insulina a1cc e usar uma seringa separada para cada rato. Também preparar seringas contendo soro fisiológico apenas para cada rato no grupo controle. Manter as seringas em gelo até estar pronto para injetar. </li><li> Anestesiar ratos com cetamina-xilazina cocktail (120 mg / kg de cetamina, 8 mg / kg de xilazina) Verifique se há profundidade anestésica adequada, observando a falta de resposta aos pés pinch. </li><li> Após a sedação adequada, raspar o cabelo que cobre a região rostral da cabeça até a região caudal do pescoço, limpe restantes cabelo longe com etanol 70%. </li><li> Rato lugar sob estereomicroscópio, e inserir agulha, paralelamente ao músculo LAL enquanto puxa levemente a agulha da seringa (Fig. 1A, B). Isso garante que a agulha é introduzida na sobrejacente tecido conjuntivo e não diretamente danificar o músculo LAL em si. Inserir a agulha de modo que a ponta abrange o aspecto caudal do músculo LAL. </li><li> Muito lentamente, começam a injectar a solução sobre o músculo direito LAL ao retirar a seringa, o tempo de injeção total deve ser de aproximadamente 1 minuto. Se injetado corretamente, a solução deve formar uma "cúpula" que é de aproximadamente 1 cm de diâmetro, na pele sobrejacente que permanecerá por pelo menos uma hora. Uma solução uniformemente injetados cobrirá a regiões inteiras rostral e caudal do músculo direito LAL. </li><li> Repita o procedimento a cada 12 horas por 1-7 dias. Para outros estudos1, foi utilizado o mesmo protocolo para injetar fatores de crescimento a cada 12 horas para até 21 dias. Sem respostas anormais foram observados em ratos administrados com anestesia 2x por dia por até 21 dias. </li></ol> 2. Dissecação dos músculos LAL <ol><li> Euthanize camundongos com uma overdose de pentobarbital sódico (390 mg / kg). A morte é assegurada por avaliar a falta de batimentos cardíacos após a toracotomia é realizada. </li><li> Pino para baixo com o mouse em um prato de dissecação, face dorsal com 1 pino em cada pata e um pino através do nariz. </li><li> Fazer a primeira incisão através da pele apenas com uma tesoura pequena mola para cortar ao longo da LAL esquerda da região proximal apenas para o ouvido para a região em torno do ombro esquerdo. </li><li> Remova cuidadosamente a pele nesta região, mas evitar o corte muito perto da orelha direita como este é um dos pontos de fixação para o músculo direito LAL. </li><li> Localize a faixa de tecido adiposo centralmente posicionado de lipídios ao longo da linha média, na superfície superficial da cabeça, onde os músculos direito e esquerdo LAL se encontram. Com uma tesoura pequena mola, corte 1 centímetro à direita do tecido adiposo (em direção à orelha esquerda) da borda proximal do músculo esquerdo LAL até atingir o ombro (Fig. 1C). </li><li> Uma vez que a incisão é feita, casca de volta o direito LAL músculo com uma pinça pequena para expor o lado ventral do músculo. Caimento do tecido conjuntivo e fáscia, enquanto cuidadosamente puxando para cima no músculo direito LAL com uma pinça (Fig. 1C). </li><li> Corte em torno da extremidade caudal da LAL direita na base da orelha. Continue cortando, movendo-se para o final rostral da orelha direita, mantendo a LAL direito virado (Fig. 1C).. É melhor incluir mais tecido nesta etapa do que o risco de danificar o LAL em si. Se o músculo começa a secar, pipeta 1X PBS sobre o músculo. </li><li> Lugar dissecados direito LAL em 30 milímetros prato de cultura contendo Sylgard 1X PBS, lado dorsal para cima. Pino para baixo quatro cantos do músculo com pinos pequeno inseto. </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras pequenas primavera, tecido conjuntivo limpa das superfícies dorsal e ventral do músculo direito LAL. Vire muscular durante e re-pin, a fim de limpar superfície ventral. 03/02 músculos podem ser colocados no mesmo prato 30mm. </li></ol> 3. Imunocoloração triplo da NMJs LAL: Dia 1 <ol><li> Antes de imunocoloração início, prepare todos os reagentes necessários. 1X PBS, 2% BSA soro albumina bovina) / PBS, 0,1 M Glycine em 2% BSA / PBS, X100 Triton 0,2% em 2% BSA / PBS e paraformaldeído a 4% (PFA) em 1X PBS serão necessários. Pré-cool metanol no freezer -20 C °. </li><li> Deixe os músculos LAL preso no lado dorsal prato durante este processo. Descartar 1X solução PBS e adicione o suficiente 4% (PFA) para cobrir o músculo. Prato lugar em shaker à velocidade de 2 ou 3 por 20 minutos. Salvo disposição em contrário, o prato deve ser colocado em um agitador para as etapas seguintes. </li><li> Descartar PFA 4% e lavar o músculo com 1X PBS três vezes, 10 'cada. </li><li> Descartar última 1X PBS lavar e adicionar 0,1 M Glycine em 2% BSA / PBS solução para 30 '. </li><li> Descartar 0,1 M solução Glycine umd adicionar 1X PBS contendo rodamina conjugado α bungarotoxin-a uma concentração de 1:200 por 15 '. </li><li> Descartar α bungarotoxin solução e lavar muscular em 1X PBS, 3 vezes 10 'cada. </li><li> Permeabilizar o tecido adicionando pré-resfriado metanol e colocar o prato no freezer -20 ° C para precisamente cinco minutos, sem agitação necessária. </li><li> Remover o metanol e lavar 3 vezes 10 'cada um com 1X PBS. Descartar última lavagem e tecido bloco com 0,2% de triton X-100 em 2% BSA / PBS por 1 hora. Os passos de lavagem e bloqueio são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Incubar os músculos durante a noite, agitando, a 4 ° C em um coquetel de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio (cf., Tabela). </li></ol> 4. Imunocoloração triplo da NMJs LAL: Dia 2 <ol><li> Lavar os músculos em 1X PBS 3 vezes, 10 'cada, à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar coquetel de anticorpos secundários em solução de bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente (cf., Tabela). Os músculos devem ser protegidos da luz a partir desse passo para prevenir foto-branqueamento de Alexa Fluor-fluorescência 647. </li><li> Lavar os músculos em 1X PBS 3 vezes, 10 'cada. </li><li> Limpe qualquer tecido conjuntivo restantes em 1X PBS, corte as bordas laterais dos músculos LAL e montagem em lâminas lado dorsal para cima, utilizando tampa de vidro-escorrega e meios de montagem. Use claro unha polonês para garantir lamínula no lugar. </li><li> Slides proteger da luz e armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para análise. </li></ol> 5. Imagem confocal de NMJs LAL <ol><li> Imagens de alta resolução confocal são obtidos com um Plano de Apo Leica objetivo de petróleo 63X (1.4NA) em um microscópio Leica TCS 4D confocal. </li><li> Fluoresceína e Alexa 647 sinais foram digitalizados com simultaneamente linhas de laser 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) e 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectivamente. Seqüencialmente, o sinal é então digitalizado Rodamina com a linha do laser 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Secções ópticas foram coletadas em intervalos de 0,3 micrômetros, o número de imagens no plano z variados 60-80. O pinhole é ajustado para 1 Airy (107,97 um). O formato de imagem 1024 x 1024 (X, Y), com um factor de zoom de 1, resultados de velocidade de 400Hz em uma imagem de tamanho M 234,32 x 234,32 mm e tamanho de pixel de 229,05 nm x 229,05 nm. </li><li> Leica software de aquisição TCS-NT é então usado para reconstruir z-series imagens em projeções de intensidade máxima. </li><li> Multipanel imagens são ajustados para o brilho eo contraste usando o Adobe Photoshop. </li><li> Para um músculo típico LAL, deve ser capaz de analisar cerca de 75-100 NMJs rosto en. Estabilidade sináptica é determinada por características tais como o alinhamento espacial de pré-, peri-e pós-sináptico elementos (ie, nervosas, células de Schwann e muscular), e as medições da área sináptica (isto é, o tamanho sinapse). </li></ol> Resultados representativos: No MNJ mamíferos adultos, um axônio único motor elabora galhos finos que forma altamente diferenciada mandris de um terminal nervoso (Fig. 2; Green) em uma única fibra muscular, precisamente apposed a clusters de pós-sinápticos AChRs nicotínico (Fig. 2; Red) . Perisynaptically, as células de Schwann terminal cobrir bem todos os ramos de terminações nervosas pré-sinápticas (Fig. 2; Azul). A integridade estrutural e funcional desta organização tripartite é gravemente perturbada pela aplicação diária de inibidores subtipo específico mAChR. No exemplo aqui apresentado (Fig. 3), 4-DAMP, um antagonista mAChR com alta afinidade para o M1, M3, M4 e M5 subtipos mAChR, evoca eliminação seletiva de terminais nervosos da NMJs numerosos em toda a superfície do músculo (Fig. 3B, C). Além disso, as células de Schwann terminal são anormalmente quiescente 8, como evidenciado pela rotulagem S100 brilhante sem extensão do processo (Fig. 3B ", 3C"). Pós-sinapticamente, as fibras musculares são normais e não há perda de nAChRs (Fig. 3B, 3C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Localização anatômica e organização do músculo LAL. Localização da rostral (rLAL), caudal (CLAL), e do nervo LAL (LALn) e placa terminal bandas correspondentes são mostradas (A, inset). A localização e orientação da agulha em relação ao músculo LAL é mostrado para o procedimento de injeção (B). Pontos de incisão são mostradas para o procedimento de dissecção (C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Tripartite organização do MNJ. Ampliação de alta vista confocal de um MNJ mouse. Um único axônio elabora ramos terminais finos (A), hermeticamente fechados por terminal de células de Schwann e seus processos (A ', ponto de asteriscos para corpos celulares terminal Schwann). Pós-sinapticamente em uma fibra muscular, um grupo de AChRs nicotínico é precisamente apposed aos ramos terminais do nervonais e células de Schwann terminal. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. LAL músculos tratados com 4-DAMP, um antagonista mAChR. Baixa e de alta ampliação visualizações confocal de músculos LAL tratados com veículo ou 4-DAMP. Em contraste com o músculo veículo-tratados (A-A NMJs'''), numerosos no 4-DAMP tratados muscular terminais falta do nervo (B-B''', C-C'''). A área de box na Figura 2B é ampliado na Figura 2C.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
<li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite a investigação de papéis previamente não reconhecido do subtipo específico mAChR sinalização na estabilidade e manutenção de NMJs mamíferos. Este método será útil também para testar os efeitos de fatores neurotróficos e agentes farmacológicos. Por exemplo, nosso laboratório constatou que fator neurotrófico ciliar (CNTF) provocou surgimento de quase todos os terminais nervosos LAL em ratos adultos <a>1</a> . Este resultado contrasta com estudos anteriores de CNTF tratados com os músculos...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> ketamina </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dose: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xilazina </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dose: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% de pureza); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropina </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Grau farmacêutico </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dose: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dose: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptídeos Internacional </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 M - 1M </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered 1X pH, solução salina 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Pescador </td><td> T353-500 </td><td> Faça solução a 10% no primeiro dissolvendo água deionizada 10g/100mL destilada; fazer 4% com 1X PBS, ajustar o pH para 7,4 </td></tr><tr><td> Sódio pentobarbitol </td><td> Virbac Saúde Animal </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dose: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Parte # 184 </td><td> Siga as instruções que vêm com o kit, pode usar placa de cultura múltiplas empresas (30mm, 60mm, 100mm), dependendo das necessidades </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Adicionar 0.185g de 25 ml de 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% albumina sérica bovina (BSA 2%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Dissolver 2g BSA em 100mL de PBS 1X </td></tr><tr><td> X100 Triton 0,2% em 2% BSA / PBS (tampão de bloqueio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100mL </td><td> Dissolver 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Use na concentração de 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Monoclonais Sternberger </td><td> SMI312 </td><td> Use na concentração de 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Estudos do Banco de desenvolvimento Hibridoma </td><td> SV2-sobrenadante </td><td> Use a concentração de 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Use na concentração de 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-cabra anti-rato IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Use na concentração de 1:200, mas se o fundo é alto, tente 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor-cabra 647 conjugado anti-coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Use na concentração de 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescentes montar mídia </td><td> Vector laboratórios </td><td> H-1000 </td><td> Esta não é uma mídia de hard-set, você vai precisar para assegurar a lamínula com unhas polonês claro. </td></tr><tr><td> Tesoura pequena Primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça de dissecção </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

a administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e triple-a imunocoloração do músculo longus levator auris em ratos

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Músculos dos membros posteriores de roedores, como o gastrocnêmio e tibial anterior, são freqüentemente usados ​​para estudos farmacológicos in vivo dos sinais essenciais para a formação e manutenção de NMJs mamíferos. No entanto, a penetração de drogas para esses músculos após subcutânea ou intramuscular é muitas vezes incompleta ou irregular e NMJs muitos podem permanecer inalteradas. Embora a administração sistêmica com dispositivos como mini-bombas podem melhorar os efeitos espaço-temporais, a natureza invasiva deste método pode causar confusão respostas inflamatórias e / ou lesão muscular direta. Além disso, a análise completa do NMJs em um músculo dos membros posteriores é desafiador porque requer demorado seccionamento serial e imunocoloração extensiva. A LAL mouse é uma folha, fino e liso do músculo localizado superficialmente no dorso do pescoço. É um músculo de contração rápida, que funciona para mover o pavilhão auricular. Ele contém porções rostral e caudal que se originam a partir da linha média do crânio e se estendem lateralmente à porção cartilaginosa de cada pavilhão. O músculo é fornecida por um ramo do nervo facial que os projetos caudalmente à medida que sai do forame stylomastoid. Nós e os outros descobriram LAL ser uma preparação conveniente que oferece vantagens para a investigação de curto e longo prazo os efeitos in vivo de drogas em NMJs e músculos. Em primeiro lugar, a sua localização superficial facilita múltiplas aplicações locais de medicamentos sob anestesia luz. Segundo, sua magreza (2-3 camadas de fibras musculares) permite a visualização e análise de quase todos os NMJs dentro do músculo. Em terceiro lugar, a facilidade de dissecando-a com a sua intacta nervo, juntamente com o padrão de sua inervação permite análise suplementar eletrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, e talvez mais importante, um pequeno volume aplicado (~ 50μl) facilmente cobre a superfície do músculo inteiro, fornece uma exposição uniforme e prolongado de todos os seus NMJs à droga e elimina a necessidade de uma abordagem sistêmica 1,8.

Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para revelar<em&gt; In vivo</em&gt; Efeitos farmacológicos NMJs.

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Os músculos dos membros posteriores de roedores, como o gastrocnêmio e o tibial anterior, são frequentemente utilizados para estudos farmacológicos in vivo de sinalizações...

O objetivo geral deste procedimento é administrar antagonistas muscarínicos aos músculos LAL de camundongos adultos e examinar as alterações morfológicas dos njs em resposta à inibição dos receptores de acetilcolina muscarínicos. Primeiro, os antagonistas muscarínicos são administrados por via subcutânea na frequência e duração desejadas. Após a eutanásia, os músculos LAL tratados são cuidadosamente dissecados e qualquer tecido conjuntivo é removido.O tecido muscular é então submetido a uma tripla marcação imunológica para visualizar as células de Schwann dos nervos motores e os receptores de acetilcolina nicotínicos, utilizando métodos-padrão de imunohistoquímica. Por fim, a microscopia confocal é utilizada para examinar as alterações morfológicas das JEN em músculos tratados com antagonistas muscarínicos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram que a organização morfológica da JEN tripartite é gravemente perturbada pela inibição dos receptores de acetilcolina muscarínicos.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a administração de compostos farmacêuticos nos músculos esqueléticos dos membros posteriores de roedores, tais como o gastrocnêmio e o tibial anterior, é que o músculo LAL é mais acessível e relativamente fino. Isso permite a aplicação local repetida de fármacos e a visualização de quase todos os njs dentro do músculo. Em uma bancada previamente limpa com etanol, dissolva a dose apropriada de antagonista do receptor de acetilcolina muscarínico em solução salina fisiológica estéril em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Aspire 50 microlitros da solução em uma seringa de insulina de um cc, utilizando uma seringa separada para cada camundongo.Prepare também seringas contendo apenas solução salina fisiológica para cada camundongo do grupo controle, mantendo todas as seringas sobre gelo até o momento da injeção. Em seguida, anestesie os camundongos com uma mistura de cetamina e xilazina. Confirme a anestesia utilizando a técnica do aperto do dedo do pé; após a sedação adequada, depile os pelos que cobrem a região rostral da cabeça até a região cervical e remova os pelos residuais com etanol a 70%. Posicione o camundongo sob um microscópio estereoscópico e insira a agulha da seringa paralelamente ao músculo LAL, de modo que a ponta cubra a região caudal.Puxe suavemente o êmbolo da seringa para garantir que a agulha esteja inserida no tecido conjuntivo sobrejacente e não danifique diretamente o músculo LAL. Comece a injetar lentamente a solução sobre o músculo LAL direito enquanto retira a seringa ao longo de aproximadamente um minuto. Se a injeção for realizada corretamente, a solução deve formar uma cúpula na pele sobrejacente que permanecerá por pelo menos uma hora.Repita o procedimento a cada 12 horas durante um a sete dias antes da eutanásia para dissecação muscular e, em seguida, fixe o camundongo em um prato de dissecação com a face dorsal voltada para cima. Faça a primeira incisão apenas na pele, utilizando pequenas tesouras de mola, cortando ao longo do LAL esquerdo da região logo proximal à orelha até a região ao redor da escápula esquerda. Remova cuidadosamente a pele dessa região, mas evite cortar muito próximo à orelha direita, pois este é um dos pontos de fixação do músculo LAL direito.Localize a faixa central de tecido adiposo com lipídio na superfície superficial da cabeça, onde os músculos LAL direito e esquerdo se encontram, utilizando pequenas tesouras de mola. Corte um centímetro à direita do tecido adiposo e em direção à orelha esquerda, partindo da borda proximal do músculo LAL esquerdo, até alcançar o ombro. Após realizar a incisão, puxe para trás o músculo LAL direito com uma pequena pinça para expor a face ventral do músculo.Retire o tecido conjuntivo e a fáscia enquanto puxa cuidadosamente o músculo LAL direito com uma pinça. Corte ao redor da extremidade do escroto do LAL direito na base da orelha e mova-se em direção à extremidade rostral da orelha direita. Mantenha o LAL direito virado para cima.É melhor incluir mais tecido nesta etapa do que correr o risco de danificar o próprio LAL. Se o músculo começar a secar, pipete um XPBS sobre o músculo.Coloque o LAL direito dissecado em uma placa de cultura de 30 milímetros contendo um XPBS com a face dorsal voltada para cima. Fixe os quatro cantos do músculo com pequenos alfinetes para insetos utilizando pinças pequenas e tesoura de mola. Remova o tecido conjuntivo da superfície dorsal do músculo LAL direito.Gire o músculo e prenda novamente para limpar a superfície ventral. De dois a três músculos podem ser colocados no mesmo recipiente de 30 milímetros para tripla imunomarcação após a incubação noturna. Incubação com anticorpo primário.Lave os músculos em um XPB S3 três vezes durante 10 minutos e, em seguida, adicione o coquetel de anticorpos secundários na solução bloqueadora por uma hora. À temperatura ambiente, mantenha os músculos em incubação protegidos da luz para evitar o desbotamento fotossensível após uma hora de incubação; lave os músculos em um XPB S3 três vezes durante 10 minutos cada. Mantendo os músculos cobertos com XPBS fresco após a última lavagem sob o microscópio estereoscópico, remova qualquer tecido conjuntivo remanescente e, em seguida, corte as bordas laterais do LAL.Monte o tecido muscular sobre a lâmina com o lado dorsal voltado para cima. Em seguida, adicione duas ou três gotas do meio de montagem. Coloque lamínulas de vidro e use esmalte incolor para fixá-las no lugar.Proteja as lâminas da luz e armazene-as a menos 20 graus Celsius até o momento da análise. Imagens confocais de alta magnificação de uma imunomarcação tripla da JNM de camundongo mostram sua organização tripartite. Os finos ramos terminais que se ramificam a partir de um único axônio, marcados com NFS V dois, são firmemente cobertos pelos corpos celulares das células de Schwann terminais e por seus processos, conforme revelado pela marcação de S 100 pós-sináptica.Uma fibra muscular, um agrupamento de receptores de acetilcolina nicotínicos encontra-se exatamente oposto aos ramos dos terminais nervosos e às células de Schwann terminais. O músculo LAL de um camundongo tratado com veículo exibe JNE, cuja organização tripartite está inalterada e apresenta arborizações altamente diferenciadas típicas do terminal nervoso, conforme demonstrado por imunomarcação tripla. Em contraste, a integridade estrutural e funcional dessa organização tripartite é gravemente perturbada pela aplicação diária de quatro DAMP.Um inibidor específico do subtipo de receptor colinérgico muscarínico. Aqui, quatro gotas provocam a eliminação seletiva de terminações nervosas de numerosos njs em toda a superfície muscular. Além disso, as células de Schwann terminais estão anormalmente quiescentes, evidenciado pela marcação intensa de S-100 sem extensão de processos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como administrar antagonistas muscarínicos aos músculos LAL e realizar uma tripla imunomarcação, para examinar as alterações morfológicas dos njs em resposta à inibição desses receptores.

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Research

JoVE Journal

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