Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 1:58 min. • July 8th, 2025
Pegue uma cultura de células contendo células cancerígenas neuronais presas a uma lamínula e mantenha-a em condições frias.
Remova o meio de cultura e lave repetidamente as células com tampão fosfato frio para eliminar o meio residual.
Adicione um tampão de lise contendo uma baixa concentração de detergente não iônico e inibidores de protease.
O detergente não iônico rompe a membrana celular para iniciar a lise.
Enquanto isso, os inibidores de protease bloqueiam as enzimas proteolíticas celulares, protegendo as proteínas da degradação enzimática.
Em seguida, use um raspador de células para desalojar as células parcialmente lisadas da lamínula.
Transfira o conteúdo para um tubo contendo o tampão de lise.
Em condições frias, use um homogeneizador para lisar mecanicamente as células, garantindo a lise celular completa e a liberação de proteínas.
Centrifugar o lisado celular.
Recolha o sobrenadante num novo tubo.
As proteínas extraídas das células tumorais neuronais estão agora prontas para análise posterior.
Para validação da expressão proteica, 48 horas após a transfecção, coloque as placas de cultura em gelo e lave as células duas vezes com PBS. Trate as células em cada prato com 200 a 400 microlitros de tampão de lise e use um raspador de células para remover as células das lamínulas.
Transfira as células destacadas de cada placa para tubos de microcentrífuga individuais e dissocie ainda mais as células com um homogeneizador sob gelo. Após um minuto, coloque os pedaços de células homogeneizadas em pellets por centrifugação.