Why use cold conditions during protein extraction?

Cold conditions help preserve protein integrity by reducing enzymatic activity and preventing degradation during lysis.

How does protease inhibition improve protein extraction reliability?

Protease inhibitors block cellular proteolytic enzymes, protecting target proteins from degradation and ensuring accurate downstream analysis.

What role does mechanical homogenization play in cell lysis?

Mechanical homogenization ensures complete cell disruption and efficient protein release following detergent-mediated membrane permeabilization.

Why is repeated washing with cold phosphate buffer necessary?

Repeated washing removes residual culture medium that could interfere with lysis buffer efficiency and contaminate protein samples.

What enables downstream analysis of extracted proteins?

The protocol yields a protein-rich supernatant suitable for quantification and detection in assays such as Western blotting or ELISA.

Extração de proteínas de células neuronais

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurociência

0 vistas • 1:58 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pegue uma cultura de células contendo células cancerígenas neuronais presas a uma lamínula e mantenha-a em condições frias.

Remova o meio de cultura e lave repetidamente as células com tampão fosfato frio para eliminar o meio residual.

Adicione um tampão de lise contendo uma baixa concentração de detergente não iônico e inibidores de protease.

O detergente não iônico rompe a membrana celular para iniciar a lise.

Enquanto isso, os inibidores de protease bloqueiam as enzimas proteolíticas celulares, protegendo as proteínas da degradação enzimática.

Em seguida, use um raspador de células para desalojar as células parcialmente lisadas da lamínula.

Transfira o conteúdo para um tubo contendo o tampão de lise.

Em condições frias, use um homogeneizador para lisar mecanicamente as células, garantindo a lise celular completa e a liberação de proteínas.

Centrifugar o lisado celular.

Recolha o sobrenadante num novo tubo.

As proteínas extraídas das células tumorais neuronais estão agora prontas para análise posterior.

Para validação da expressão proteica, 48 horas após a transfecção, coloque as placas de cultura em gelo e lave as células duas vezes com PBS. Trate as células em cada prato com 200 a 400 microlitros de tampão de lise e use um raspador de células para remover as células das lamínulas.

Transfira as células destacadas de cada placa para tubos de microcentrífuga individuais e dissocie ainda mais as células com um homogeneizador sob gelo. Após um minuto, coloque os pedaços de células homogeneizadas em pellets por centrifugação.