Isolamento de fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral

Tome um extrato de tecido cerebral de camundongo contendo proteínas não amilóides e fibrilas amilóides, um agregado de proteína insolúvel.

Adicione sacarose sólida e misture, aumentando a densidade da solução.

Transfira-o e centrifugue para separar as proteínas mais densas dos detritos.

Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o pellet num tampão de maior concentração de sacarose, misturar e centrifugar.

Colete a camada superior contendo algumas fibrilas amilóides em um tubo novo, adicione um tampão de lavagem e misture.

Agora, descarte a camada intermediária e transfira o pellet enriquecido com fibrilas amilóides para o tubo que contém a fração da camada superior para isolamento máximo.

Centrifugar as fracções combinadas e rejeitar o sobrenadante. Adicione um tampão de digestão e incube para degradar exclusivamente as proteínas não amilóides.

Centrifugue e remova o sobrenadante. Lave o pellet para remover as proteínas digeridas residuais.

Ressuspenda o pellet em um tampão de solubilização à base de sacarose contendo detergente que solubiliza as proteínas não amilóides restantes.

Centrifugue, remova o sobrenadante e ressuspenda as fibrilas amilóides isoladas.

Comece colocando uma região de tecido cerebral recém-dissecada ou congelada em um tubo de dois mililitros contendo seis a oito esferas de cerâmica e tampão de homogeneização gelado recém-preparado. Em seguida, triture o tecido usando um homogeneizador de moinho de esferas a 4.000 RPM, com dois ciclos de 30 segundos de pulso ligado e desligado. Agora, adicione nove mililitros de tampão de homogeneização gelada ao mililitro de homogeneizado de tecido cerebral em um tubo de 15 mililitros e sele com tiras de filme de cera de laboratório.

Para garantir uma solubilização robusta, mantenha o tubo girando durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, adicione sacarose sólida à suspensão do extrato tecidual até uma concentração final de 1,2 moles. Misture bem e centrifugue a 250.000 vezes g por 45 minutos a 4 graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em dois mililitros de tampão de homogeneização contendo 1,9 molar de sacarose por trituração e centrifugar a 125.000 vezes g por 45 minutos a 4 graus Celsius.

Após a centrifugação, transfira a camada sólida branca superior para um tubo novo e solubilize em 1 mililitro de tampão de lavagem gelada pipetando para cima e para baixo várias vezes. Como o pellet também é enriquecido com fibrilas amilóides, descarte a camada intermediária aquosa e combine o pellet com a camada superior para obter um maior rendimento. Centrifugue as frações combinadas a 8.000 vezes g por 20 minutos a 4 graus Celsius.

Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de digestão gelada e incube em temperatura ambiente por três horas em um vórtice. Centrifugue a amostra novamente, em seguida, lave o pellet duas vezes em 1 mililitro de tampão Tris gelado e centrifugue novamente. Após a segunda lavagem, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de solubilização pipetando para cima e para baixo e centrifugue rapidamente o tubo a 200.000 vezes g por 60 minutos a 4 graus Celsius.

Salve o pellet, então, reduza a concentração de sacarose de 1,3 para 1 molar adicionando 50 tampão Tris milimolar ao sobrenadante. Centrifugue novamente o sobrenadante e, em seguida, dissolva ambos os grânulos em 100 microlitros de tampão Tris contendo 0,5% de SDS. Para purificação de amilóide, solubilize os pellets ricos em amilóide usando ondas de ultrassom em um dispositivo de sonicação de banho por 20 ciclos. Em seguida, centrifugue imediatamente o material a 20.000 vezes g por 30 minutos a 4 graus Celsius.

Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão SDS Tris a 0,5% e repita a lavagem mais quatro vezes. Após a etapa final de centrifugação, lave o pellet em 200 microlitros de água ultrapura e centrifugue a 20.000 vezes g por 30 minutos a 4 graus Celsius para remover qualquer detergente restante. Dissolva o pellet final contendo fibrilas amilóides purificadas em 100 microlitros de água ultrapura.