Name: Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a monitorar o fechamento do tubo neural em embriões de rato usando cultura ex vivo. Este método permite manipulação farmacológica direta, auxiliando pesquisadores a estudar defeitos do tubo neural.

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Gostaríamos de agradecer o laboratório de A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) eo laboratório de L. Niswander (U of Colorado-Denver) para conselhos úteis com técnicas de dissecação e cultura. Este trabalho tem sido apoiado por NRSA NS059562 para JDG e RO1NS05897 para MER em colaboração com L. Niswander e Nadeau J. (Institute for Systems Biology).

1. Preparação de meios de cultura - todos os reagentes estão listados na Tabela 1 <ol><li> Thaw soro de ratos machos a 37 ° C. </li><li> Heat-Inativar soro de ratos por 30 minutos a 55 ° C </li><li> Soro dos ratos, no 10K centrífuga por 5 minutos em temperatura ambiente </li><li> Remover 50:50 sobrenadante e misture com fenol vermelho-livre DMEM w / glicose alta </li><li> Esterilizar os meios de comunicação utilizando um filtro de seringa de 0,45 hm </li><li> Pelo menos 1 ml de media / embrião deve ser preparado </li></ol> 2. Isolamento do útero da mãe grávida <ol><li> Usando procedimentos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC), a barragem é a primeira grávida anestesiados e sacrificados por deslocamento cervical </li><li> Esterilizar o abdômen com EtOH 70% </li><li> Aperte um pequeno caminho de pele ao longo da linha média, pouco acima da linha dos mamilos, com uma pinça grande e abrir o abdômen debaixo de seu fórceps com uma tesoura grande. Tenha cuidado para não danificar nenhuma estrutura internas </li><li> Use a tesoura para cortar lateralmente a partir da abertura inicial para cada lado do mouse para que todo o abdômen está aberto </li><li> Intestinos e excesso de bolsas de gordura pode muitas vezes obscuros no útero e essas devem ser movidas de lado para que a parte superior do útero e ovários pode ser observado em cada lado </li><li> Aperte a parte superior do útero abaixo os ovários e use a tesoura para separar o útero a partir da gordura, o corte de uma extremidade do útero ao ovário outros </li><li> Retire do útero com o forceps e colocar em uma placa de Petri com solução salina </li></ol> 3. Remoção dos embriões do útero <ol><li> Lavar o útero com solução salina para remover qualquer excesso de sangue e aparar o excesso de gordura do lado de fora </li><li> Transferir para um prato limpo, com temperatura ambiente. Tyrodes salina para melhorar a visualização </li><li> Usando um microscópio estereoscópico, separe cada embrião usando uma tesoura pequena multa ou se necessário (# 5) fórceps cuidadosamente casca do útero distante. </li> &lt;li&gt; Inserir uma pinça fina para o espaço entre a parede uterina ea decídua e descole da parede uterina, tomando cuidado para não furar o embrião </ol> 4. Remoção de decídua de embriões <ol><li> Orientar o decidua de modo que a parte mais escura (placenta) está voltado para longe de você </li><li> Faça uma incisão com o fórceps ao longo da linha que separa a parte escura do decidua do isqueiro parte, tomando cuidado para não cortar demasiado profundamente </li><li> Completar a separação da placenta da parte superior do saco vitelino, tomando cuidado para não rasgar o cone ectoplacental (EPC). Neste ponto, você deve ser capaz de visualizar a membrana Reicherts no saco vitelino </li><li> Continue para remover o decidua inteiro (mais leve porção) tomando cuidado para não furar o saco vitelino </li><li> Aperte suavemente e remover o Reicherts por raspagem-lo longe do EPC. Se o EPC está danificado ou separado do saco vitelino, embriões vai deixar de vez normalmente a partir E8.5-E9.5 </li><li com o reicherts removida do embri deve ser facilmente vis atrav saco vitelino e pode encenado por somities contagem.></ol> 5. Configurando o sistema de cultura <ol><li> Cortar o final de uma pipeta de plástico com uma tesoura para aumentar o diâmetro da abertura para que um embrião pode ser pipetado sem danificar o saco vitelino </li><li> Encher garrafas roller limpo com 1 ml de mídia por embrião. Dependendo do tipo de garrafas de rolo usado um máximo de 3-6 embriões podem ser colocados em cada garrafa. </li><li> Transferência de embriões utilizando a pipeta cortada para a garrafa cheia de rolos de mídia, transportando mais como Tyrodes mínimo possível de modo a não diluir a mídia </li><li> Anexar a ficha de borracha (bung) para a parte superior da garrafa de vidro rolo </li><li> Inserir as garrafas roller no tambor cultura rolo de modo que uma boa vedação é formada entre o plug eo tambor </li><li> Uma vez que todas as garrafas foram anexados, e quaisquer espaços vazios no tambor foram selados wrolhas de borracha ith, ative o rolo </li><li> Abra CO 2 e O 2 tanques e ajustá-los a cerca de 2 psi, de modo que a válvula de saída está lançando uma bolha por segundo. Para E8.5-E10 embriões, 20% O 2 e 5% CO 2 deve ser usado. </li><li> Garantir que a incubadora está definida para 37 ° C e cobrir ou fechar a incubadora para que os embriões são protegidos da luz. </li><li> Embriões devem ser verificados periodicamente para avaliar o seu desenvolvimento através da adição de somities, a progressão de transformar, e na medida de fechamento do tubo neural </li><li> Depois de 2-3 horas de cultura, inibidores farmacológicos ou outros tratamentos podem ser adicionados aos meios de comunicação </li><li> O desenho do estudo deve incluir controles, como veículo ou análogos inativos do reagente de estudo. </li></ol> 6. Avaliação do desenvolvimento após a cultura de embriões todo <ol><li> Desligue o gás, pare de rolo, e remover as garrafas de incubadora </li><li> Embriões transferir de volta para Tyrodes ou PBS em uma placa de Petri para avaliação sob estereomicroscópio </li><li> O saco vitelino deve aparecer balão-como, num piscar de olhos devem ser visíveis e freqüência cardíaca deve ser&gt; 120 batimentos por minuto, ea circulação deve ser evidente </li><li> Embriões fotografia antes de yolk sac remoção, se necessário </li><li> Remover saco vitelino do embrião, cortando um buraco perto da EPC e lançando o saco vitelino e âmnio sobre a cabeça e garupa do embrião. </li><li> O cordão umbilical pode ser cortado para separar o saco vitelino do embrião e do saco vitelino pode ser usado para genotipagem do embrião, se necessário. </li><li> Examine o embrião para o número de somito e defeitos do tubo neural, tais como dobras abertas cranial, fechamento incompleto da face e / ou um neuroporo aberta caudal. Embriões podem ser estadiados segundo a classificação de alterações Theiler morfogenética múltipla ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ emap / home.html</a> ) Mais uma vez, um registro fotográfico dedesenvolvimento embrionário é útil. </li></ol> 7. Notas <ol><li> A dissecção de alta qualidade é essencial, porque qualquer nick ou lágrimas no saco vitelino impedirá virando sucesso e inibir o desenvolvimento normal. O EPC também podem ser danificados durante a remoção da membrana de Reichert (RM), e se o EPC é ainda parcialmente separado do saco vitelino, os embriões não se desenvolverá normalmente. No entanto, a remoção incompleta da RM pode causar embriões para ficar juntos e / ou células RM podem overgrow na cultura e na gema de constrição expansão saco, sendo que ambos vão impedir o desenvolvimento normal. </li><li> Pinças limpas e nítidas são o segredo para obter uma dissecção bom, porque fórceps maçante ou dobradas tornar o processo muito mais difícil. Depósitos de proteínas em instrumentos vai levar a danos nos tecidos. </li><li> Limpa, garrafas de vidro estéreis também são essenciais para evitar que embriões de degola para a parede lateral e sendo danificado. Antes de iniciar o experimento, as garrafas devem ser scrubbed com água e sabão, enxaguados em dH 2 O, e microondas com uma pequena quantidade de água em cada garrafa até que a água ferve. Garrafas são então lavados com EtOH 70% e permitiu secar ao ar. </li><li> Trabalho o mais rápido possível, porque quanto mais cedo o embrião pode ser transferida para os meios de cultura e aquecido de volta para 37 ° C a sobrevivência do melhor. </li><li> Completa dissecar toda a ninhada antes de transferir qualquer embriões para garrafas de rolos de modo que cada embrião é a temperatura ambiente para a mesma quantidade de tempo para evitar a criação de alguma discrepância no crescimento do embrião </li><li> Manter um ambiente estéril para evitar contaminação bacteriana das culturas. Experimentos nossa cultura ter sido realizada sem antibióticos, mas muitos laboratórios adicionar antibióticos para seus meios de comunicação para prevenir o crescimento bacteriano. O meio deve aparecer como clara no final do experimento como era no início do experimento. Se a mídia tornou-se nublado ou há um precipitado visível, provavelmente haverá um concontaminação que infectou sua cultura. </li><li> Troca gasosa ineficaz também pode retardar o desenvolvimento de embriões, por isso não deixe de ter um regulador de confiança que vai garantir a entrega contínua. </li><li> Embriões se desenvolvem cerca de 50% mais lento em cultura ex vivo, portanto, é essencial contar somitos para garantir que você tenha atingido o estágio adequado de desenvolvimento para a conclusão do experimento. </li></ol> 8. Resultados representativos: O aparecimento de embriões pré e pós-roller-cultura é ilustrada na Figura 1. No momento da dissecção, os embriões devem estar em uma configuração unturned (Fig. 1A, D) onde a cauda está por trás das dobras cabeça. Após 36 horas de cultura, os embriões deverão ter concluído o giro de modo que eles estão no C-curva, posição fetal, onde a cauda está na frente da cabeça (Fig 1B, C, E, F). Manipulação farmacológica com inibidores da quinase RhoA (Y-27632), um conhecido inibidor da extensão convergente duranteneurulação (Ybot-Gonzalez, 2007), resulta em um encurtamento dos embriões ao longo de seu eixo rostral-caudal (Fig. 1E, F) e inibe o fechamento do crânio neural dobra. Nossos dados mostram que doses crescentes de Y-27632 progressivamente prejudica fechamento vezes cranial (Figura 2A) e encurta o eixo do corpo (Fig. 2B), de acordo com o papel de downstream RhoA sinalização em neurulação cranial e extensão convergente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg"> Figura 1. Aspecto de culturas e manipulação de embriões com o inibidor farmacológico Y-27632. (A D) embriões dissecado em E8.5 antes da cultura de embriões todo (B, E) em embriões E10 com o saco vitelino ainda intacto, após a 36hrs da cultura russa. (C, F) O saco vitelino foi removido para ilustrar virando sucesso e fechamento do tubo neural. Embriões que foram tratadas com o inibidor da quinase Rho Y-27632 (E, F) não se submeter a extensão convergente adequada e ilustramum eixo do corpo encurtado. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg"> Figura 2. Efeito do inibidor da quinase RhoA no fechamento do tubo neural craniana e alongamento do eixo. (A) A porcentagem de embriões que foram capazes de fechar com sucesso as suas dobras cranial (NTC% = percentagem fechamento do tubo neural) é comparada com a dose de Y-27632 adicionado ao meio de cultura. (B) A distância entre a vesícula ótica e forelimb foi significativamente reduzida em doses crescentes de Y-27632 (p &lt;0,05).

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A capacidade de separar materna, fatores intra-uterinos daqueles que são intrínsecos ao embrião durante o seu desenvolvimento é uma importante ferramenta para o estudo de todas as fases da embriogênese. Aqui analisamos os efeitos de uma pequena molécula de inibidor da quinase do utero RhoA cranial neurulação ex, eliminando assim a variável do metabolismo materno da droga. Esta manipulação farmacológica tem um efeito profundo sobre neurulação cranial e extensão convergente. Sensibilidade a este composto pode ser comparado entre os diferentes mutantes rato genético. O método aqui apresentado também pode ser aplicado em estudos de outras vias moleculares em desenvolvimento, permitindo a manipulação direta da função celular em embriões utilizando uma variedade de reagentes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Estereomicroscópio para Dissecção </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de precisão </td><td> BTC Engenharia (Reino Unido) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Cultura rotativa Bottle </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Garrafas de vidro para Rotating Unidade </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Bung de borracha de silicone </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Cork Rubber </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gás Bubbler Inlet </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Armadilha de entrada de gás Bubbler </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Saída de gás Bubbler </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Cilindro de gás </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Regulador de gás </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Serum Rat masculino </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM vermelho w / o de fenol </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de seringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura grande Dissecando (ponta Blunt) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Tesoura </td><td> Multa Ferramentas Científica (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 forceps </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode de Saline </td><td></td><td></td><td> Conforme descrito na Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 centímetros prato de Petri descartáveis </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

fechamento do tubo neural no embrião do rato cultura whole

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Modelos de ratos genéticas são uma importante ferramenta no estudo de fechamento do tubo neural de mamíferos (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). No entanto, o estudo dos embriões de camundongos in utero é limitado pela nossa incapacidade de manipular diretamente farmacologicamente os embriões no isolamento dos efeitos do metabolismo materno sobre o reagente de interesse. Seja usando uma pequena molécula, a proteína recombinante, ou siRNA, a entrega dessas substâncias para a mãe, através da dieta ou por injecção sujeitará estes compostos instáveis ​​a uma variedade de defesas corporais que poderiam impedi-los de alcançar o embrião. Investigações em culturas de todo o embrião pode ser usado para separar materna intrínseca de efeitos sobre o desenvolvimento fetal. Aqui, apresentamos um método para cultivo de embriões de rato usando a mídia altamente enriquecido em um aparelho de incubadora de rolos que permite o fechamento do tubo neural normal, após a dissecção (Crockett, 1990). Uma vez que na cultura, os embriões podemser manipulados usando técnicas in vitro convencional que não seria possível se os embriões ainda estavam no útero. Irmãos embrião pode ser coletadas em vários pontos do tempo para estudar os diferentes aspectos da neurulação, ocorrendo a partir E7-7.5 (formação de placa neural, pouco antes do início da neurulação) para E9.5-10 (na conclusão do neuroporo dobrar e caudal do crânio fechamento, Kaufman, 1992). Neste protocolo, demonstramos o nosso método para a destruição de embriões em intervalo de tempo que são ideais para o estudo da neurulação craniana. Os embriões serão dissecados em E8.5 (aprox. 10-12 somities), após o início do fechamento do tubo neural, mas antes de ligar embrião e fechamento neural cranial fold, e mantidos em cultura até E10 (26-28 somities), quando cranial neurulação deve ser completa.

Um método que permite a manipulação farmacológica direta de embriões de camundongos durante a neurulação que ultrapassa o metabolismo materno é descrito. A técnica pode ser adaptada para estudar os diferentes aspectos da neurulação, variando o ponto de tempo e agente farmacológico.

Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

Modelos genéticos de camundongos são uma ferramenta importante no estudo do fechamento do tubo neural de mamíferos (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). No entanto, o estudo de camundongos...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar os eventos de alongamento do eixo neuroembrionário e fechamento do tubo neural em embriões de camundongo, em um ambiente extrauterino no qual as condições podem ser definidas. Isso é realizado primeiramente removendo-se os cornos uterinos do camundongo grávido anestesiado no dia gestacional ou embrionário 8,5. Em seguida, embriões individuais de camundongo são removidos do útero com suas bolsas vitelinas intactas e grande parte da decídua.Em seguida, o tecido decidual extraembrionário é removido, mantendo-se intacto o cone ectoplacentário. O passo final do procedimento é transferir os embriões em seus sacos vitelinos para frascos rotativos contendo meio com ou sem agentes farmacológicos em teste e cultivar os embriões por 18 a 24 horas em uma incubadora com gasificação contínua. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram a adição progressiva de somitos, a aproximação das dobras neurais e o fechamento com a rotação do embrião para a curvatura em forma de C característica da posição fetal.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área, como quais vias moleculares estão envolvidas no fechamento normal do tubo neural. Quais agentes ou suplementos podem ajudar a promover a ovulação normal, especialmente em embriões que possuem mutações genéticas que os predispõem a defeitos do tubo neural ou DTNs. A demonstração visual desta técnica é essencial, pois as etapas da dissecação podem ser muito desafiadoras.Os embriões são pequenos e podem ser facilmente danificados, e danos ao saco vitelino podem comprometer o desenvolvimento somático. Além disso, a viragem e o desenvolvimento do sistema circulatório também podem ser prejudicados, impedindo um resultado bem-sucedido. Para começar, prepare o meio de cultura descongelando soro de rato macho a 37 graus Celsius. Em seguida, inative o soro de rato por 30 minutos a 55 graus Celsius.Em seguida, centrifugue a 10.000 RPM durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante e misture-o em uma proporção de um para um com DMEM sem vermelho de fenol e com alta concentração de glicose. Estérilize o meio utilizando um filtro de seringa de 0,45 mícron.Isole o útero e coloque-o em uma placa de Petri com solução salina para remover os embriões. Primeiro, lave o útero com solução salina para remover qualquer sangue em excesso e retire a gordura adicional da parte externa. Transfira-o para uma placa limpa com solução salina de Tyrode à temperatura ambiente para melhorar a visualização em um microscópio estereoscópico, com as mãos estabilizadas sobre a platina.Use uma tesoura pequena ou pin&ccedil;as finas para separar o &uacute;tero e isolar cada embri&atilde;o. Insira as pin&ccedil;as finas no espa&ccedil;o entre a parede uterina e a d&eacute;cidua, e retire a parede uterina com tra&ccedil;&atilde;o m&iacute;nima para evitar romper o saco vitelino. Em seguida, posicione a d&eacute;cidua de modo que a placenta fique voltada para longe de voc&ecirc;.Em seguida, faça uma incisão com a pinça ao longo da linha, separando a porção escura da decídua da porção mais clara, tomando cuidado para não cortar muito profundamente. Complete a separação da placenta do topo do saco coriônico.Tendo cuidado para não rasgar o cone ectoplacentário ou EPC. Neste momento, a membrana de Riker no saco vitelino deve estar visível. A remoção da membrana de Riker do saco vitelino é a parte mais difícil do procedimento e exige paciência e mão firme.Para remover delicadamente o riker sem danificar o saco vitelino subjacente, continue removendo toda a decídua. Tendo cuidado para não perfurar o saco vitelino, pinçe e remova suavemente a membrana riker, destacando-a do EPC. Se o EPC for danificado ou separado do saco de carvalho, os embriões não conseguirão virar normalmente de E 8,5 para E 9,5.Uma vez removida a membrana de riker, o embrião deve ficar facilmente visível através do saco vitelino. Estágio do embrião contando os somitos ao longo de um dos lados, começando abaixo da vesícula otica e terminando na cauda com uma tesoura. Corte a extremidade de uma pipeta de transferência plástica para usá-la no embrião sem danificar o saco vitelino.Encha frascos rotativos limpos com um mililitro de meio por embrião. Dependendo do tipo de frasco rotativo utilizado, um máximo de três a seis embriões pode ser carregado em cada frasco. Usando a pipeta cortada, transfira os embriões para o frasco rotativo contendo o meio, levando o menor volume possível de tyros, para não diluir o meio.Acople a tampa de borracha na parte superior do frasco de vidro com rolete. Insira os frascos com rolete no tambor de cultura rotativa de modo que seja formado um selo hermético entre a tampa e o tambor. Depois que todos os frascos tiverem sido acoplados, feche quaisquer orifícios vazios no tambor com tampões de borracha.Em seguida, ative o rolo agitador. Abra então o tanque de pré-mistura de CO2 O2 e ajuste-o para aproximadamente duas PSI, de modo que a válvula de saída libere uma bolha por segundo. Para embriões E 8,5 e E 10, devem ser utilizados 20% de O2 e 5% de CO2.Certifique-se de que o incubador esteja ajustado a 37 graus Celsius e cubra ou feche o incubador para que os embriões fiquem protegidos da luz. Para avaliar o desenvolvimento embrionário, verifique-os periodicamente quanto à adição de somitos, ao avanço da rotação e ao grau de fechamento do tubo neural após duas a três horas de cultivo; se desejado, adicione inibidores farmacológicos ou outros tratamentos. Quando a incubação estiver concluída, desligue o gás, pare o rolete e remova os frascos do incubador.Transfira os embriões de volta para tyros ou PBS em uma placa de Petri. Sob o microscópio estereoscópico, o saco vitelino deve parecer inchado como um balão, um batimento cardíaco deve ser visível e a circulação deve estar evidente. Remova o saco vitelino do embrião cortando um orifício próximo à EPC e virando o saco vitelino e o âmnio sobre a cabeça e a região lombar do embrião. Corte o cordão umbilical para separar o saco vitelino do embrião.Por fim, examine o embrião quanto ao número de somitos e defeitos do tubo neural, tais como dobras cranianas abertas, fechamento incompleto do rosto e/ou poro neural caudal aberto. Os embriões podem ser estagiados de acordo com a classificação de Tyler, baseada em múltiplas alterações morfogenéticas. A aparência dos embriões antes e após o cultivo em rolete é ilustrada aqui no momento da dissecação. O embrião deve estar em uma configuração não virada, onde a cauda está localizada atrás das dobras da cabeça.Após 24 horas em cultura, os embriões devem ter concluído a voltação, de modo que estejam em posição fetal curvada em C, com a cauda à frente da cabeça. Esta imagem mostra, na linha superior, o desenvolvimento de embriões sem inibidores adicionados. A linha inferior mostra o efeito da manipulação farmacológica com o inibidor da quinase da linha A Y 2 76 32, um inibidor conhecido da extensão convergente durante a alação.Esse inibidor resulta em um encurtamento dos embriões ao longo do eixo caudal e inibe o fechamento do dobramento neurocraniano. Nossos dados mostram que doses crescentes de Y 2 7 6 3 2 prejudicam progressivamente o fechamento do dobramento craniano e encurtam o eixo corporal, o que é compatível com o papel da sinalização downstream da via. Uma vez dominada, a técnica de dissecação pode ser concluída em 60 a 90 minutos para uma ninhada de seis a 12 embriões.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão das etapas necessárias para cultivar embriões de camundongo do oitavo e meio ao décimo dia de gestação com o objetivo de estudar mecanismos de desenvolvimento em nível sistêmico.

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

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Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

A cultura de embriões inteiros de mamíferos (WEC) é amplamente utilizada em teratologia e biologia do desenvolvimento. O soro de rato imediatamente centrifugado é comumente fornecido como meio para WEC de camundongo e rato. Neste vídeo, demonstramos nosso protocolo padrão para a preparação de soro de rato de alta qualidade adequado para WEC de mamíferos.

Preparação de Rat Serum Indicado para cultura de embriões de mamíferos Whole

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

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Placa neural de Murine Alvo por In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) no Dia Embrionário 7.5

Uma plataforma aprimorada para a cultura de embriões integrais permite o desenvolvimento contínuo e robusto do ex útero de embriões de camundongos pós-implantação por até seis dias, desde estágios de pré-estresculação até organogênese avançada. Neste protocolo, detalhamos o procedimento padrão para a cultura de embriões bem sucedida usando placas estáticas e sistemas de garrafas rotativas.

Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Aprenda a monitorar o fechamento do tubo neural em embriões de rato usando cultura ex vivo. Este método permite manipulação farmacológica direta, auxiliando pesquisadores a estudar defeitos do tubo neural.

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