Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

O objetivo geral deste procedimento é detectar RNAs mensageiros em neurônios individuais. Isso é feito por patch clamping e registro de neurônios individuais e, em seguida, aspira completamente o citoplasma de cada neurônio registrado do Mr.mRNA e do citoplasma. CD NA é feito e amplificado por PCR.

Em última análise, mRNAs específicos para receptores, canais iônicos e enzimas podem ser detectados por meio de um sistema de imagem de gel convencional. Meu nome é, eu trabalho no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método terão dificuldades porque a quantidade de ressonâncias magnéticas em um único neuro é extremamente pequena e facilmente perdida.

Comece este protocolo usando um vibrador para cortar fatias de cérebro coronal de 300 micrômetros de espessura contendo a parte rostral média da nigra substancial. Os cérebros podem ser isolados de ratos spra dolly de 15 a 40 dias de idade. O procedimento de corte de fatias é realizado gelado em uma solução de corte com alto teor de sacarose, oxigenada com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e, a um pH de 7,4, incubar as fatias em líquido cefalorraquidiano artificial e borbulhar com 5% de dióxido de carbono, 95% de gás oxigênio.

Mantenha a temperatura em 34 graus Celsius e deixe as fatias lá por 45 minutos. Em seguida, mantenha as fatias do cérebro em temperatura ambiente até a gravação. Comece transferindo uma fatia de cérebro para uma câmara de gravação de patch clamp.

Perfundido continuamente com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado a 32 graus Celsius. Encha as pipetas de adesivo com solução intracelular de autoclave preparada com água livre de DNAs e RNAs. Coloque uma pipeta carregada no banho.

Verifique se a resistência está entre dois e três mega ohms. Primeiro, localize o nigra substancial por sua localização distinta e anatômica. Em seguida, usando a óptica namar e uma objetiva de 60 x, selecione células grandes no SNC e SNR para gravação.

Estes são possíveis neurônios dopaminérgicos ou GABAérgicos sem hesitação. Use uma configuração convencional de célula inteira de vedação apertada giga para fazer o grampo de corrente e o grampo de tensão. Esses registros geralmente devem ser realizados em menos de cinco minutos para minimizar a degradação do mRNA.

Em cerca de um minuto, é possível fornecer impressões digitais eletrofisiológicas para os neurônios de interesse, registrando apenas suas propriedades de membrana e pico. Depois de obter dados de um neurônio de interesse, use uma sucção suave na boca para aspirar o citoplasma. O selo apertado não deve ser quebrado como de outra forma.

Detritos extracelulares, incluindo mRNA, podem ser sugados para dentro da pipeta de adesivo e contaminar o conteúdo celular. Expulse o conteúdo celular para um tubo de PCR de 0,2 mililitro quebrando a ponta da pipeta e aplicando uma leve pressão positiva. Quando terminar, coloque imediatamente o tubo em um freezer negativo 20 para descartar a contaminação de detritos extracelulares que possam conter mRNAs.

Faça um controle negativo coletando o conteúdo de uma pipeta de adesivo baixada no tecido sem usar qualquer aspiração. Depois de coletar o conteúdo celular de 10 a 20 neurônios, inicia-se imediatamente a reação de transcrição reversa. Para minimizar a degradação dos mRNAs, comece digerindo qualquer DNA genômico contaminante com DNAs, um por cinco minutos, A 25 graus Celsius.

Essa etapa é fundamental para reduzir possíveis falsos positivos e não deve ser contornada. Em seguida, inative os DNAs com 1,2 microlitros de EDTA 25 milimolares e incube as amostras a 70 graus Celsius por cinco minutos. Agora, use um kit disponível comercialmente para sintetizar o CD NA para verificar se o DNA genômico foi completamente removido.

Execute uma reação de controle de cada amostra sem transcriptase reversa. Enquanto todos os outros componentes da reação permanecem os mesmos. Armazene os produtos a menos 20 graus Celsius até que sejam necessários para o projeto de PCR.

Os primers de acordo com as sequências no banco Gen, sempre que possível, fazem uma introdução de T abrangendo reparos primários para ajudar a detectar a contaminação do DNA genômico. Para verificar a eficácia dos pares de primers, teste-os em todo o cérebro CD NA para o primeiro estágio. A PCR amplifica cinco microlitros dos CDNAs de 30 microlitros por 35 ciclos usando um protocolo de ciclagem térmica padrão.

Para o segundo estágio, a PCR amplifica um microlitro do produto de PCR do primeiro estágio com o mesmo reparo primário e usa um perfil de ciclagem ligeiramente modificado. Agora separe os produtos em um gel 2,5% AGROS e visualize-os usando brometo de AUM ou gel verde. Sob luz UV, excise as bandas de DNA positivas e sequencie-as usando um kit disponível comercialmente para coletar o DNA.

As características eletrofisiológicas dos neurônios na nigra substancial, pars, compacta e pars reticulata foram comparadas. Os neurônios SNR GABAérgicos exibiram maior frequência, com picos espontâneos em torno de 10 hertz. Os picos tiveram uma duração de base em torno de um milissegundo após a injeção de corrente hiperpolarizante.

Os neurônios SNR GABAérgicos exibiram uma resposta SAG sutil, indicando uma corrente ativada semanalmente. Em contraste, os neurônios dopaminérgicos nigro exibiram picos espontâneos de baixa frequência com uma duração de base de cerca de três milissegundos. Os neurônios dopaminérgicos também mostraram um SAG pronunciado em resposta à hiperpolarização, indicando uma forte expressão da corrente IH nos neurônios GABAérgicos SNR, mas não nos neurônios dopaminérgicos.

R-T-P-C-R de célula única detectou mRNA para ácido glutâmico descarboxilase um, uma enzima chave na síntese de GABA. Em contraste, um identificou neurônios dopaminérgicos SNC e SNR, mas não em neurônios GABAérgicos. R-T-P-C-R de célula única detectou mRNA para tirosina hidroxilase, uma enzima chave para a síntese de dopamina.

Em seguida, a célula única R-T-P-C-R foi usada para traçar o perfil da expressão de subunidades de três canais KV ativadas por voltagem, que variam as propriedades dos canais de potássio dependentes de voltagem. No exemplo SNR gaba, os mRNAs dos neurônios para KV 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 foram detectados apenas em um exemplo de neurônio SNR-DA. KV 3.2, 3.3 e 3.4 foram detectados em dados agrupados.

O KV 3.1 foi detectado com mais frequência em neurônios SNR GABAérgicos do que em neurônios dopaminérgicos nigro, indicando um nível de expressão mais alto de KV 3.1 nos neurônios SNR GABA Viking rápidos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e manter as ferramentas que a ciência está livre após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a expressão e a função dos receptores e dos canais iônicos no sistema nervoso.