Avaliação da colonização bacteriana em um cérebro de camundongo após infecção por Listeria monocytogenes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:18 min • July 8th, 2025
Pegue um cérebro de rato perfundido no buffer.
O cérebro está infectado com Listeria monocytogenes resistente à estreptomicina, uma bactéria patogênica.
A etapa de perfusão remove o sangue do cérebro, garantindo que as medições da carga bacteriana reflitam a carga de Listeria monocytogenes no tecido.
Em seguida, homogeneizar o cérebro usando um homogeneizador esterilizado para quebrar o tecido e liberar bactérias.
Agora, prepare diluições em série do homogeneizado cerebral usando tampão.
Coloque essas diluições em placas de ágar de infusão cérebro-coração contendo estreptomicina, um antibiótico.
Incube as placas. O ágar de infusão cérebro-coração fornece nutrientes para o crescimento de Listeria monocytogenes, enquanto a estreptomicina seleciona bactérias resistentes, permitindo a formação apenas de colônias de Listeria resistentes à estreptomicina.
Conte o número de colônias na placa para determinar as unidades formadoras de colônias, uma medida da carga bacteriana infecciosa viável no cérebro.
Usando uma pinça, abra o crânio para expor o cérebro e coloque uma espátula entre a parte inferior do cérebro e a base do crânio para transferir cuidadosamente o cérebro para um tubo de 15 mililitros contendo 5 mililitros de PBS de 4 graus Celsius.
Em um gabinete de biossegurança, insira a ponta e execute um homogeneizador de tecidos por 10 segundos em soluções sequenciais de alvejante a 5%, água estéril, etanol a 75% e água estéril em tubos cônicos separados de 15 mililitros. Quando a ponta estiver completamente esterilizada, homogeneizar o cérebro infectado em seu tubo.
Prepare diluições seriadas dez vezes maiores de cada homogeneizado de órgão em PBS estéril e coloque as diluições em placas de ágar de infusão cérebro-coração. Em seguida, incubar as culturas de diluição homogeneizada a 37 graus Celsius durante a noite e contar o número de colônias em cada placa para determinar o número total de bactérias por órgão ou mililitro de sangue.
Visão Geral
Este artigo demonstra um protocolo para quantificar a carga bacteriana infectante de Listeria monocytogenes no cérebro de camundongos perfundidos. O método envolve o processamento cuidadoso do tecido, plaqueamento seletivo e contagem de colônias para avaliar com precisão a carga bacteriana no tecido cerebral após infecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Pesquisa em doenças infecciosas
- Neurociência
Antecedentes
- Listeria monocytogenes é uma bactéria patogênica capaz de infectar o cérebro.
- A quantificação da carga bacteriana no tecido cerebral é essencial para estudar a dinâmica da infecção e as interações entre hospedeiro e patógeno.
- A perfusão remove o sangue, garantindo que as medições reflitam as bactérias presentes no próprio tecido cerebral.
- O plaqueamento seletivo permite a identificação e a quantificação de cepas bacterianas resistentes a antibióticos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível para mensurar a carga de Listeria monocytogenes em tecido cerebral de camundongo.
- Garantir a quantificação precisa mediante a remoção de sangue e o cultivo seletivo de bactérias resistentes.
- Facilitar estudos sobre infecção cerebral e patogênese bacteriana.
Métodos Utilizados
- Perfusão de camundongos para remoção de sangue do cérebro.
- Dissecação e transferência do cérebro para PBS frio.
- Homogeneização do tecido cerebral utilizando um homogeneizador esterilizado.
- Preparação de diluições seriadas decimais do homogeneado cerebral em PBS estéril.
- Plaqueamento das diluições em ágar infusão cerebral-coração contendo estreptomicina.
- Incubação das placas a 37°C durante a noite.
- Contagem de colônias bacterianas para determinar unidades formadoras de colônia (UFC).
Resultados Principais
- Isolamento e quantificação bem-sucedidos de Listeria monocytogenes resistente à estreptomicina a partir de tecido cerebral de camundongo.
- Medição precisa da carga bacteriana viável em UFC por órgão ou por mililitro de sangue.
- Demonstração de um fluxo de trabalho confiável para avaliação de infecção cerebral em modelos experimentais.
Conclusões
- O protocolo descrito permite a quantificação precisa de Listeria monocytogenes em cérebros de camundongos perfundidos.
- A perfusão e o plaqueamento seletivo são essenciais para a avaliação precisa da carga bacteriana específica de tecido.
- Este método auxilia pesquisas sobre patogênese bacteriana e respostas do hospedeiro no cérebro.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da colonização bacteriana em tecido cerebral de camundongo perfundido permite uma avaliação precisa da dinâmica da infecção e da carga patogênica específica do tecido. Este fluxo de trabalho apoia a redução de riscos mecanicistas em modelos de doenças infecciosas e orienta a validação de alvos em estudos de interação hospedeiro-patógeno. A medição precisa da carga bacteriana é fundamental para pesquisas translacionais e decisões em portfólios de P&D de agentes anti-infecciosos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação rigorosa de hipóteses de infecção em tecido cerebral relevante para a doença.
- Apóia a validação funcional de interações entre hospedeiro e patógeno e de alvos da resposta imune.
- Fornece dados quantitativos para desvio mecanicista de riscos e confiança nos alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um fluxo de trabalho validado para quantificar a carga bacteriana viável em tecido cerebral.
- Facilita a reprodutibilidade e padronização do ensaio por meio de plaqueamento seletivo e diluições seriadas.
- Gera resultados quantitativos (UFC) adequados para triagem posterior e estudos comparativos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos de infecção com tecidos relevantes para a doença no desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de estratégias anti-infecciosas.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base na carga quantitativa de infecção.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao contínuo de descoberta de doenças infecciosas, desde a verificação inicial de hipóteses até a validação de modelos pré-clínicos e a pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Fornece quantificação robusta para testes de hipóteses e esclarecimento de vias em modelos de infecção cerebral.
- Triagem: Fornece medições padronizadas e reprodutíveis de UFC para prontidão de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite comparação quantitativa da carga bacteriana entre condições experimentais e intervenções.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao modelar infecção em tecidos relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo reutilizável para diversos estudos de infecção e colonização tecidual.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de infecção.
- Valor Operacional: Padroniza a quantificação bacteriana e melhora a reprodutibilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e otimiza a alocação de recursos em portfólios de agentes anti-infecciosos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos de infecção e estratégias terapêuticas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, perfusão e técnica estéril.
- Necessita de acesso a cabines de segurança biológica, homogeneizadores de tecidos e placas de ágar seletivo.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para quantificação reprodutível de UFC.
- Adaptável a outros tipos de tecidos e modelos de infecção mediante modificações no protocolo.
- Depende de diluições seriadas precisas e contagem de colônias para resultados confiáveis.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
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Última atualização: 29 agosto 2026