Imunomarcação de interneurônios em uma secção hipocampal de rato

Pegue uma seção fixa do hipocampo de ratos contendo um interneurônio cheio de biocitina, uma molécula conjugada com biotina.

Em seguida, adicione uma solução contendo proteínas bloqueadoras e um detergente não iônico para evitar ligações inespecíficas e permeabilizar os neurônios.

Incubar com um anticorpo primário direcionado a receptores canabinóides específicos em interneurônios.

Lave com tampão para remover o excesso de anticorpos.

Em seguida, adicione um corante fluorescente conjugado com estreptavidina e um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo.

Durante a incubação, a estreptavidina se liga fortemente à biocitina, permitindo a visualização do interneurônio preenchido com biocitina, enquanto o anticorpo secundário tem como alvo os anticorpos primários ligados ao receptor nos interneurônios.

Enxágüe com tampão, removendo as moléculas não ligadas.

Agora, monte a seção usando mídia de montagem aquosa. Posicione uma lamínula e feche-a.

Usando um microscópio de fluorescência, visualize a expressão do interneurônio e do receptor canabinóide preenchido com biocitina, permitindo a análise da morfologia do interneurônio e da distribuição do receptor.

Bloqueie os tecidos com soro bloqueador a 10% por uma hora em temperatura ambiente. Posteriormente, incubar as seções no anticorpo primário CB1R à temperatura ambiente durante a noite, para identificar a expressão do receptor canabinóide tipo um. Em seguida, lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar. A estreptavidina e o anticorpo secundário ao primeiro anticorpo primário são adicionados à placa do poço e mantidos durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, incubar as seções no conjugado de corante vermelho estreptavidina a quatro graus Celsius durante a noite no escuro para revelar a biocitina. Depois disso, lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar. Para proteger a fluorescência e facilitar a recoloração no futuro, monte as seções em um meio de montagem aquoso e sele as bordas das lamínulas com esmalte transparente.