Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:36 min. • July 8th, 2025
Pegue uma seção fixa do hipocampo de ratos contendo um interneurônio cheio de biocitina, uma molécula conjugada com biotina.
Em seguida, adicione uma solução contendo proteínas bloqueadoras e um detergente não iônico para evitar ligações inespecíficas e permeabilizar os neurônios.
Incubar com um anticorpo primário direcionado a receptores canabinóides específicos em interneurônios.
Lave com tampão para remover o excesso de anticorpos.
Em seguida, adicione um corante fluorescente conjugado com estreptavidina e um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo.
Durante a incubação, a estreptavidina se liga fortemente à biocitina, permitindo a visualização do interneurônio preenchido com biocitina, enquanto o anticorpo secundário tem como alvo os anticorpos primários ligados ao receptor nos interneurônios.
Enxágüe com tampão, removendo as moléculas não ligadas.
Agora, monte a seção usando mídia de montagem aquosa. Posicione uma lamínula e feche-a.
Usando um microscópio de fluorescência, visualize a expressão do interneurônio e do receptor canabinóide preenchido com biocitina, permitindo a análise da morfologia do interneurônio e da distribuição do receptor.
Bloqueie os tecidos com soro bloqueador a 10% por uma hora em temperatura ambiente. Posteriormente, incubar as seções no anticorpo primário CB1R à temperatura ambiente durante a noite, para identificar a expressão do receptor canabinóide tipo um. Em seguida, lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar. A estreptavidina e o anticorpo secundário ao primeiro anticorpo primário são adicionados à placa do poço e mantidos durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, incubar as seções no conjugado de corante vermelho estreptavidina a quatro graus Celsius durante a noite no escuro para revelar a biocitina. Depois disso, lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar. Para proteger a fluorescência e facilitar a recoloração no futuro, monte as seções em um meio de montagem aquoso e sele as bordas das lamínulas com esmalte transparente.