Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 6:31 min. • July 8th, 2025
Colher o tecido da eminência ganglionar medial, contendo progenitores interneurônios corticais, de embriões de camundongos geneticamente modificados.
Adicione um polímero catiônico e dissocie o tecido em uma suspensão unicelular.
Adicione vetores lentivirais carregando um repórter GFP dependente de Cre recombinase ladeado por locais de salmão defumado. Incubar.
O polímero neutraliza as cargas da membrana viral e da célula hospedeira, permitindo a fusão viral e a liberação de RNA.
O RNA viral é transcrito reversamente e integrado ao genoma do hospedeiro.
Centrifugue e descarte o sobrenadante. Absorva o excesso de mídia.
Transfira as células para uma superfície hidrofóbica e carregue-as em um dispositivo de injeção.
Injete as células no córtex de um filhote de camundongo anestesiado.
Permita que o filhote se recupere e cresça.
Os progenitores transplantados se diferenciam em interneurônios maduros no córtex.
Um subgrupo desses interneurônios co-expressa Cre recombinase e RFP.
Nesses interneurônios, Cre extirpa os locais de salmão defumado, invertendo o gene GFP e permitindo sua expressão.
Visualize a co-expressão RFP e GFP para identificar interneurônios que expressam Cre.
Depois de preparar o lentivírus e dissecar o MGE de acordo com as instruções do protocolo escrito, colete os dois hemisférios do MGE e coloque o tecido em dois tubos de coleta de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de DMEM com 10% de FBS.
Mantenha as amostras no gelo até que todo o tecido seja coletado. Em seguida, transfira os tubos para um capô com certificação BSL-2. Aspire cuidadosamente o meio sem perturbar os tecidos MGE depositados no fundo do tubo.
Em seguida, adicione cerca de 500 microlitros de DMEM pré-aquecido com 10% de mídia FBS. Adicionar o polibreno a uma concentração final de 8 microgramas por mililitro e titular através de uma ponta de pipeta P1000 até obter uma suspensão unicelular. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros do lentivírus concentrado a cada tubo.
Em seguida, feche bem cada tubo, inverta para misturar e, em seguida, coloque todos os tubos em uma incubadora de 37 graus Celsius. Incube as células com o lentivírus por pelo menos 30 minutos, mas não mais de uma hora, pois tempos mais longos resultaram em diminuição da viabilidade celular. Inverta os tubos a cada 10 minutos.
Após a incubação, remova os tubos da incubadora e centrifugue a 700 vezes g a 4 graus Celsius por três minutos para peletizar as células. No capô BSL-2, remova o sobrenadante e descarte em 10% de alvejante. Em seguida, adicione 1 mililitro de DMEM com 10% de FBS e titule o pellet duas a três vezes para lavar.
Depois de centrifugar como antes, repita esta etapa de lavagem mais duas a três vezes para remover o excesso de vírus. Após a lavagem final, remova o máximo de mídia possível e coloque cada tubo no gelo.
Devido ao meio residual nas laterais do tubo, aproximadamente 2 a 3 microlitros de meio acabarão cobrindo o pellet celular, no momento em que o procedimento de transplante for iniciado. Enquanto garante que a técnica estéril seja usada por toda parte, coloque o óleo mineral em uma seringa de 1 mililitro e, em seguida, com uma agulha de calibre 30,5, encha a pipeta de vidro completamente com o óleo mineral.
Em seguida, conecte a pipeta de vidro ao dispositivo estereotáxico e carregue no êmbolo. Com um assistente usando o acionamento hidráulico, mova o êmbolo até a metade da pipeta de vidro, removendo o óleo mineral que derrama com uma toalha de papel limpa.
Em seguida, torça o canto de uma toalha de papel estéril em uma ponta fina e use-a para remover delicadamente o excesso de mídia acima do pellet da célula MGE. Isso concentrará a densidade celular para que volumes de injeção menores possam ser alcançados.
Em seguida, use uma pipeta P2 para puxar lentamente o pellet celular e titular uma a duas vezes antes de dispensar em uma superfície hidrofóbica. O volume deve ser pouco inferior a 1 microlitro.
Mova a ponta da agulha para dentro da suspensão da célula e, usando o acionamento hidráulico, puxe a suspensão da célula para dentro da pipeta. Depois de anestesiar um filhote por hipotermia, verifique a eficácia da anestesia beliscando a pele entre os dedos dos pés com uma pinça. Nenhuma reação deve ser vista.
Em seguida, coloque o filhote em um molde que esteja sob o dispositivo de injeção e estique a pele puxando a pele da cabeça para trás e prendendo com fita adesiva padrão. Trabalhando rapidamente, manipule o braço estereotáxico para posicionar a ponta da pipeta de vidro na cabeça do filhote, perpendicular à superfície da cabeça.
Quando a pipeta estiver em contato com a cabeça, considere isso um zero. Em seguida, empurre a pipeta através da superfície da pele e do crânio para o córtex. Em seguida, insira e retraia a pipeta duas vezes antes de parar.
Para direcionar as células para o neocórtex, as injeções são realizadas quando a micropipeta está a uma profundidade de 0,1 milímetro. Quando a agulha estiver na posição, gire o dispositivo hidráulico para avançar o êmbolo na pipeta de vidro e injete 50 a 70 nanolitros por local.
Repita este procedimento em três a seis locais diferentes em diferentes níveis rostral-caudais se for necessária uma ampla distribuição de células transformadas em todo o neocórtex. Quando as injeções estiverem concluídas, remova o filhote do palco e marque-o de acordo com os procedimentos aprovados.
Assim que o filhote se recuperar e for capaz de se mover sozinho, coloque-o de volta com a fêmea lactante e o resto da ninhada. Verifique os filhotes após o procedimento e no dia seguinte, para garantir que não haja sinais de deterioração da saúde.