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Pegue uma placa de vários poços contendo neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal do rato transfectado.
Os neurônios do poço de teste exibem expressão reduzida do receptor de neuropeptídeos, enquanto os neurônios do poço de controle exibem níveis fisiológicos de expressão do receptor de neuropeptídeos.
Substitua o meio por meio sem soro para fornecer um ambiente controlado para uma resposta de estimulação precisa.
Adicione um agonista do receptor neuropeptídico aos poços e misture. Incube a placa.
No poço de controle, o agonista do receptor neuropeptídico se liga aos receptores-alvo, desencadeando uma cascata de sinalização intracelular que libera neurotransmissores.
No entanto, nos poços de teste, a expressão reduzida do receptor de neuropeptídeos limita a ligação do agonista, levando à diminuição da liberação de neurotransmissores em comparação com o controle.
Após a incubação, colete o meio dos poços e centrifugue.
Transfira o sobrenadante para tubos e use um imunoensaio adequado para medir os níveis de neurotransmissores. A amostra de controle exibe maior liberação de neurotransmissores do que a amostra de teste após estimulação do agonista do neurorreceptor.
No dia 6, após o plaqueamento e 72 horas após a transfecção de siRNA, troque o meio de cultura para 200 microlitros de meio livre de soro. Após uma incubação de 30 minutos, adicione 1 microlitro do produto químico de estimulação e misture delicadamente pipetando. Após incubar pelo período necessário, colete o meio de cultura da placa de cultura e centrifugue a 5.000 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius para remover quaisquer impurezas suspensas. Colete o sobrenadante da centrifugação e dilua com solução salina tamponada com fosfato, conforme necessário.
