Name: Aumentar os rendimentos cDNA Single-cell quantidades de mRNA em Laboratório Padrão Reações transcriptase reversa usando Microstreaming Acústico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Aprenda a aumentar o rendimento de cDNA a partir de mRNA de célula única usando microstreaming acústico em reações de transcrição reversa padrão. Este método melhora a mistura de fluidos em pequenas escalas.

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Este estudo foi financiado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (projeto de subsídio não. 6.288.480) e os Scobie e Clare MacKinnon Trust.

1. Micromixing uma reação RT <ol><li> Antes de executar uma reação de RT com micromixing, equilibrar a micromisturador para a temperatura desejada da reação de RT. <ol><li> Coloque o micromisturador dentro de um 37 ° C (ou a temperatura recomendada pelo fornecedor RT) incubadora de pelo menos 1 hora antes do início da reação de RT. </li></ol></li><li> Configure o mix RT de acordo com a transcriptase reversa do fornecedor (por exemplo, MMTV-RT da Promega, Omniscript da Qiagen) instruções, excepto o uso de uma única célula quantidades de RNA total de entrada (por exemplo, 0.1-1pg/μl), ao invés do g-ng quantidades recomendadas pelos fornecedores. <ol><li> Usamos padrão estéril, livre de nuclease 200μL tubos de paredes finas PCR. </li></ol></li><li> Posição tubos RT firmemente na micromisturador assim que estão prontos para a mistura. O micromisturador deve permanecer dentro da incubadora de 37 ° C para a duração da reação de RT. </li><li> Selecione a freqüência adequada e amplitude de micromixing. Neste exemplo, vamos usar 150Hz. </li><li> Mudar o micromisturador sobre e deixe-a por toda a duração da reação de RT (60 minutos). </li><li> Mudar o micromisturador e levar os tubos RT uma vez a reação RT está completa. </li><li> Coloque os tubos no gelo RT e prossiga normalmente com outras aplicações, tais como Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (qPCR ou PCR em tempo real). </li></ol> 2. Resultados representativos: O benefício de micromixing no contexto de reações RT é um aumento no rendimento em relação ao cDNA quando outros métodos de mistura (por exemplo, agitação, vórtex ou trituração) são utilizados. Isto pode ser visto, por exemplo, na análise subseqüente do cDNA Reação em Cadeia da Polimerase utilizando quantitativa (qPCR ou PCR em tempo real). Figura 2A ilustra os efeitos da micromixing para os primeiros cinco minutos (azul, "micromixed5") ou a totalidade de 60 minutos (vermelho ", micromixed60") em comparação com a trituração da reação RT imediatamente anterior à incubação RT (preto, "trituração" ). Neste caso o volume da reação de RT anterior foi 25μL e continha 2.5pg de RNA total. traços qPCR usando oligonucleotídeos desenhados para detectar cDNA representando Nurr-1 mRNA são mostrados acima, e os meios ± SEMs do número de ciclos para chegar a fluorescência máxima de 50% em três repetições deste mesmo experimento são plotados abaixo. O asterisco representa uma diferença estatisticamente significativa (one-way ANOVA com comparações múltiplas de Tukey). Note-se que micromixing para os primeiros cinco minutos da reação RT anterior produziu uma melhoria não significativa mais de trituração enquanto micromixing para toda a 60 minutos da reação RT anterior produziu uma melhoria significativa sobre a trituração, a magnitude do que foi equivalente a cerca de 15 qPCR ciclos, em média. O benefício de micromixing também pode ser visto na análise da curva de fusão dos produtos qPCR subseqüentes obtidos. No experimento ilustrado na Figura 2B, micromixing para toda a 60 minutos da reação RT anteriores resultaram em um sinal consistente qPCR em amostras duplicadas (Figura 2BA, 2 traços vermelhos), enquanto micromixing para os primeiros 5 minutos ou trituração só produziu qPCR inconsistentes traços (Figura 2BA, 2 traços azuis e dois traços negros, respectivamente). Os traços cinza são controles negativos ("neg.") Na qual cDNA foi deixado de fora da reação qPCR. Quando os produtos qPCR deste experimento foram desnaturados por ramping sua temperatura (isto é, análise da curva de fusão) era evidente que certos produtos PCR (ou seja, um amplicon que era idêntico ao obtido quando as concentrações muito maiores de mRNA foram transcritas e reverter amplificado pela qPCR, dados não mostrados) estavam presentes apenas reações seguintes RT que tinha sido micromixed por 60 minutos (Figura 2BB, 2 traços vermelhos). Todos os outros (isto é, micromixed5, trituração e controles negativos) gerados produtos amplicon alternativo (por exemplo, dímeros primer). <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de fluxo do protocolo para aplicação micromixing a reações padrão de laboratório RT. Descrições mais detalhadas sobre o princípio físico envolvido, a micromisturador e como construir um micromisturador in-house são fornecidos nas referências 13,14 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Dados Representante qPCR ilustrando os benefícios da micromixing aplicado a reações anteriores RT composto de uma única célula quantidades de mRNA em outra forma padrão de reações de laboratório RT. Vestígios Um Exemplo qPCR detectar mRNA representando cDNA que codifica a Nurr-1 gene. As reações anteriores RT contidas 2.5pg de RNA total em um volume de 25μL e foram realizadas em uma incubadora a 37 ° C por 60 minutos. RT reações foram misturados por trituração do RT misturar antes de incubação (traços pretos ", trituração"), micromixed durante os primeiros cinco minutos da reação de RT (traços azuis ", micromixed5") ou micromixed para toda a 60 minutos da reação de RT (traços vermelhos ", micromixed60" ). Médias ± SEMs do número de ciclos de qPCR necessária para alcançar a fluorescência máxima de 50% são plotados abaixo para n = 3 repetições deste experimento. Asterisco indica uma diferença significativa (one-way ANOVA com comparações múltiplas de Tukey). Experimento B Outra qPCR examinar Nurr-1 produto cDNA, desta vez seguintes reações RT contendo 25pg de RNA total em um volume de 25μL. traços qPCR (a), bem como análise da curva de fusão dos produtos obtidos qPCR (b) são mostradas para as diferentes condições de mistura. Controles negativos em que nenhum cDNA foi incluído na reação de RT anteriores também estão incluídos (traços cinza ", neg."). RT reações com concentrações muito maiores de mRNA também foram realizadas e produziram picos de fusão curva (dados não mostrados) idênticos aos (b) para micromixed60 (traços vermelhos) amostras.

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método de aplicação do micromixing a reações padrão de laboratório RT descrito aqui pode, evidentemente, envolvem mRNA colhidas através de qualquer método (por exemplo, células de lise, microdissecção de captura de laser). Pode também incluir quaisquer marcas ou tipos de reagentes RT, qualquer temperatura (dentro da tolerância dos materiais do micromisturador), e qualquer período de tempo. Por exemplo, temos observado melhoria rendimentos cDNA a partir de reações RT compreendendo hexâmero aleatória ou oligo-dT primers...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> RNA total foi isolado de pressão agudamente congelados preparados fatias mesencéfalo adulto do rato </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PicoPure RNA Isolation Kit </td><td> Arcturus, CA, EUA </td><td> KIT0204 </td><td> O kit já está disponível na Applied Biosystems </td></tr><tr><td> DNA livre de DNase Tratamento e Reagentes Remoção </td><td> Ambion </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> Aleatória hexâmero primers </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV-RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP set </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin Inibidor ribonuclease </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease água livre de </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green PCR Master Mix </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> HPRT frente (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HPRT reversa (20mer): TAT CCC GTC TGA CGT CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 frente (23mer): CAG CTC TTT CGA CTT AAC TCC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 reversa (23mer): GAG GGT CAT GTC GCT AAA CTT GA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Espectrofotômetro. </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Corbett Rotor Gene RG-6000 </td><td> Corbett Life Science </td><td></td><td> Corbett Life Science foi adquirida pela QIAGEN em Julho de 2008 </td></tr></tbody></table>

aumentar os rendimentos cdna single-cell quantidades de mrna em laboratório padrão reações transcriptase reversa usando microstreaming acústico

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Expressão do gene correlacionar com o comportamento das células deve ser feito preferencialmente ao nível de uma única célula. No entanto, este não é facilmente alcançado porque a pequena quantidade de mRNA lábil presente em uma única célula (1-5% de 1-50pg RNA total, ou 0,01 2.5pg-mRNA, por célula 1) na maior parte degrada antes que possa ser transcrito reverso em uma cópia estável cDNA. Por exemplo, usando reagentes de laboratório padrão e hardware, apenas um pequeno número de genes podem ser avaliados qualitativamente por célula 2. Uma maneira de aumentar a eficiência do padrão reverso laboratório transcriptase (RT) reações (reagentes ou seja padrão em volumes microlitro) compreendendo uma única célula quantidades de mRNA seria mais rapidamente misturar os reagentes de modo que o mRNA pode ser convertido em cDNA antes que ele se degrada. No entanto, este não é trivial, pois em escalas microlitro fluxo de líquido é laminar, isto é, métodos atualmente disponíveis de misturar (isto é, agitação, vórtex e trituração) deixar de produzir movimento caótico suficiente para efetivamente misturar reagentes. Para resolver este problema, micro-escala de técnicas de mixagem tem que ser usado 3,4. Uma série de microfluídicos tecnologias baseadas em mistura, foram desenvolvidas com sucesso aumentar o rendimento de reação RT 5-8. No entanto, as tecnologias de microfluídica requerem hardware especializado que é relativamente caro e ainda não amplamente disponível. Uma solução mais barata, mais conveniente é desejável. O objetivo principal deste estudo é demonstrar como a aplicação de uma nova técnica &quot;micromixing&quot; a norma reações laboratório RT composto de uma única célula quantidades de mRNA aumenta significativamente sua produção de cDNA. Encontramos rendimentos cDNA aumentar em cerca de 1-10 vezes, o que permite: (1) um maior número de genes a ser analisados ​​por célula; (2) uma análise mais quantitativa da expressão do gene, e (3) melhor detecção de baixa abundância genes em células individuais. O micromixing é baseado em acústica microstreaming 12/09, um fenômeno onde as ondas sonoras propagando em torno de um pequeno obstáculo criar uma vazão média perto do obstáculo. Temos desenvolvido um dispositivo baseado em microstreaming acústica (&quot;micromisturador&quot;) com uma simplificação chave; microstreaming acústico pode ser alcançado em freqüências de áudio, assegurando o sistema tem uma interface líquido-ar com um pequeno raio de curvatura 13. O menisco de um volume microlitro de solução em um tubo fornece um raio de curvatura pequeno adequadamente. O uso de freqüências de áudio significa que o hardware pode ser barato e versátil 13, e ácidos nucléicos e outros reagentes bioquímicos não são danificadas, como eles podem estar com sonicators padrão de laboratório.

Descrevemos um novo método para aumentar a produtividade cDNA de uma única célula quantidades de mRNA em outra padrão de laboratório reações de transcrição reversa. A novidade reside na utilização de um micromisturador, que utiliza o fenômeno da microstreaming acústico, para misturar fluidos em escalas microlitro mais eficaz do que tremer, vórtex ou trituração.

Aumentar os rendimentos cDNA Single-cell quantidades de mRNA em Laboratório Padrão Reações transcriptase reversa usando Microstreaming Acústico

A correlação entre a expressão gênica e o comportamento celular é idealmente realizada ao nível de célula única. No entanto, isso não é facilmente alcançado porque a pequena quantidade de...

Este procedimento aumenta os rendimentos de cDNA a partir de quantidades de mRNA de uma única célula. Comece equilibrando o microagitador dentro de uma incubadora ajustada à temperatura desejada para a reação de transcrição reversa. Em seguida, prepare reações-padrão de RT em laboratório, contendo quantidades de RNA de uma única célula em volumes de microlitros.Posicione o tubo de reação com segurança nos orifícios de mistura, selecione os parâmetros apropriados de mistura e ligue o micromisturador. Em última análise, este procedimento pode ser utilizado para obter maiores rendimentos de cDNA por meio de PCR quantitativa como preparação para a reação de RT. Equilibre o micromisturador em um incubador a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora.Em tubos PCR estéreis padrão, livres de nucleases, de 200 microlitros com paredes finas. Monte as reações de transcriptase reversa de acordo com as instruções do fornecedor, exceto usar quantidades equivalentes a uma única célula de RNA total de entrada. Agora, selecione a frequência e amplitude apropriadas para a mistura por micropipetagem.Em seguida, posicione o tubo com segurança no micromisturador. Então, ligue o micromisturador. Deixe a reação prosseguir por 60 minutos; ao final, desligue o micromisturador e transfira as reações para gelo para uso imediato em aplicações downstream subsequentes. Em comparação com outros métodos, a principal vantagem da mistura em micromisturador no contexto de reações de RT é o rendimento de DNAc.Nesta análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa, os traçados de QPCR utilizando primers projetados para detectar cDNA representando mRNA de neuro um ilustram os efeitos da mistura MICROM durante os primeiros cinco minutos ou os 60 minutos completos, em comparação com a duração da reação de RT imediatamente anterior à incubação de RT. A mistura MICROM durante os primeiros cinco minutos não resultou em melhoria significativa em relação à ausência de mistura. No entanto, a mistura MICROM durante os 60 minutos completos produziu uma melhoria significativa no rendimento, equivalente a 15 ciclos de QPCR.Além disso, a análise da curva de dissociação de QPCR demonstra que a mistura em microescala durante os 60 minutos completos da reação anterior R dois produz um sinal consistente em amostras duplicadas, conforme mostrado nos traços vermelhos. Isso contrasta com os traços variantes observados com mistura em microescala apenas nos primeiros cinco minutos, conforme mostrado em azul, ou com agitação apenas, conforme mostrado nos traços cinza-escuros; os traços pretos são controles sem modelo.

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