Name: Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda a realizar microscopia de fluorescência em lapso de tempo automatizada para visualizar células bacterianas vivas de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae. Este método permite estudar dinâmicas de proteínas e comportamento celular em nível de célula única.

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Trabalho no grupo de JWV é apoiado por uma Marie-Curie UE Reintegração Fellowship, um Grant Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), a Horizon subvenção (ZonMW) e por uma bolsa VENI (NWO-ALW). O grupo de OPK é apoiado por várias bolsas STW (NWO), um SYSMO1 (IGdeJ) e SYSMO2 subvenção, as ESF EUROCORES SynBio subvenção (SynMod) e pelo Centro de Genômica Kluyver de Fermentação Industrial eo Instituto Superior de Alimentação e Nutrição.

<ol><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li>
<li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li>
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<li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li>
<li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li>
<li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li>
<li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li>
<li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li>
<li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSICIC%3A+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li>
<li>Montero, L. lopis P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li>
<li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types%3A+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li>
<li>Hoskins, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li>
<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em contraste com muitas outras técnicas única célula, o lapso de tempo método de microscopia de fluorescência descrita aqui pode ser usado para acompanhar a história de uma célula específica em relação aos seus ancestrais, seu comportamento, e eventos divisão. Em combinação com os promotores alvo fluorescente etiquetado ou proteínas, a ativação via específica de desenvolvimento podem ser acompanhadas em tempo e localização de proteínas assim como a dinâmica de proteínas podem ser monitorados durante o desenvolvimento de bactérias. Como indicado acima, os estudos concentrando-se em diferentes espécies bacterianas pode ser realizada através da adaptação das condições de crescimento de acordo com os requisitos para uma bactéria específica. As únicas limitações que encontramos estão relacionados com as condições de crescimento e tamanho da amostra. Devido a um ambiente fechado, condições médias não podem ser alterados durante o experimento. Além disso, um máximo de quatro cepas por experimento pode ser monitorado de forma eficiente. Considerando-se a poucos passos de crítica, o método de análise única célula descrito aqui pode ser facilmente aplicado utilizando qualquer microscópio automatizado. A seguir, uma visão geral dessas etapas críticas será dado. Informações detalhadas podem ser encontradas no texto principal preparação geral:. É aconselhável verificar as definições de focagem automática necessários para uma bactéria específica antes do experimento. Da mesma forma, aproximar as configurações ideais para a visualização de fluorescência deve ser determinado de antemão, se possível. Além disso, seguindo uma linha do tempo preparado ajuda a ter todo o material pronto para ser usado em tempo (pré-aquecimento da câmara de microscópio, as configurações de programação microscópio, preparando o slide uma hora antes que as células estão em fase de crescimento desejado, ver Figura 1) . Crescimento do B. subtilis no TLM e MDL: TLM e MDL são quimicamente definido media inanição em que B. subtilis só cresce lentamente. O período de tempo no qual as células são cultivadas em meios de comunicação pode ter que ser prolongado, dependendo da cepa específica. O lento crescimento impede que as células de empilhar uns sobre os outros Preparação da amostra do microscópio:. Bolhas de ar entre a estrutura genética, a lâmina de vidro ea lamínula tem que ser prevenida para evitar a secagem extensiva do meio agarose-based. O mesmo vale para a interface de deslizamento médio / tampa. É crucial para permitir que as células seco o suficiente, para evitar a natação e / ou crescimento de múltiplas camadas lapso de tempo de microscopia de fluorescência:. Pré-aquecimento do slide, bem como a câmara ambiental é crucial para evitar problemas de focagem automática principais. Células devem ser selecionados no meio de um bloco de ágar, uma vez que estes têm a maior chance de ficar no campo e foco durante o experimento (desde que a amostra foi seca bem o suficiente). Um máximo de 10 locais por experiências ainda funciona corretamente. Depois de ter seleccionado a primeira célula de interesse apenas usar o software para ajustar o foco (ver texto para detalhes). Verificar se as células ainda estão em foco durante as primeiras horas do experimento, em intervalos de 30 min Análise:. É importante verificar antes de procedimentos de análise estendida se o fundo do meio tem valores semelhantes nos canais de fluorescência. Pequenas partículas de poeira, componentes médio, as lentes sujas ou minúsculos pedaços de agarose podem contribuir para o aumento de fluorescência localmente, tornando o filme difícil ou impossível analisar Resolução de problemas:. Se as células crescem em cima uns dos outros, isso pode tanto indicar que a lamela foi anexado muito cedo ou que o meio não é adequado para o crescimento de monocamadas microcolony. Se as células de interesse continuamente morrem prematuramente, enquanto que outras células no slide dividir felizmente, você pode querer verificar se você colocar o filtro UV na posição. Ele também pode ajudar a diminuir o tempo de exposição ou intensidade de luz durante as experiências de comprimento.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Gene Quadro </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 centímetros </td></tr><tr><td> de alta resolução baixa temperatura de fusão agarose </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> lamínula grande </td><td> vários </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> se desejar, membrana tintura, por exemplo, FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> corantes membrana outras também estão disponíveis: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Lapso de tempo microscópio com câmara ambiental </td><td> vários </td><td></td><td> ver detalhes para o nosso dispositivo nas secções correspondentes </td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas de bacillus subtilis e streptococcus pneumoniae usando microscopia lapso de tempo automated

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Durante os últimos anos os cientistas se tornaram cada vez mais conscientes de que os dados médios obtidos a partir de experimentos população microbiana baseada não são representativos do comportamento status, ou fenótipo de células individuais. Devido a essa nova visão o número de estudos única célula aumenta de forma contínua (para revisões recentes ver 1,2,3). No entanto, muitas das técnicas aplicadas única célula não permitem acompanhar o desenvolvimento eo comportamento de uma única célula específica no tempo (por exemplo, citometria de fluxo ou microscopia padrão). Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um método de microscopia utilizada em vários estudos recentes 4, 5, 6, 7, que permite seguir e de gravação (fluorescência) individual células bacterianas de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae através do crescimento e divisão por muitas gerações. Os filmes resultantes podem ser usados ​​para construir árvores filogenéticas linhagem traçando volta a história de uma única célula dentro de uma população que se originou de um ancestral comum. Este lapso de tempo método de microscopia de fluorescência não pode ser usado apenas para investigar a divisão, crescimento e diferenciação de células individuais, mas também para analisar o efeito da história da célula e ascendência sobre o comportamento celular específica. Além disso, lapso de tempo de microscopia é ideal para examinar a dinâmica de expressão gênica e localização de proteínas durante o ciclo celular bacteriana. O método explica como preparar as células bacterianas e construir a lâmina de microscópio para permitir que o crescimento de células individuais em uma microcolony. Em resumo, as células individuais são vistos em uma superfície semi-sólida composta por meio de crescimento suplementado com agarose em que crescem e se dividem em um microscópio de fluorescência dentro de uma câmara de temperatura controlada ambiental. As imagens são capturadas em intervalos específicos e são posteriormente analisados ​​usando o software de código aberto ImageJ.

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para monitorar o comportamento de células individuais de diferentes bactérias no tempo usando automatizado de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, fornecem diretrizes como analisar as imagens de microscopia.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

Durante os últimos anos, os cientistas tornaram-se cada vez mais conscientes de que os dados médios obtidos em experimentos baseados em populações microbianas não são...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de células vivas durante o crescimento e a divisão por meio de microscopia de fluorescência, de modo que o efeito da história e da ancestralidade celular no desenvolvimento celular de bactérias possa ser estudado. Isso é realizado primeiramente transferindo as células de um meio líquido com concentrações relativamente altas de nutrientes para um meio líquido de privação nutricional. Em seguida, utiliza-se uma lâmina de microscopia na qual as células bacterianas crescerão formando uma microcolônia.A monocamada é preparada. Em seguida, é gravado um filme de microscopia de fluorescência com lapso de tempo. Por fim, o filme é processado e os dados são analisados.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram o desenvolvimento de uma única célula bacteriana ao longo do tempo por meio de microscopia de fluorescência com lapso de tempo. A principal vantagem desta técnica em relação a técnicas existentes, como citometria de fluxo e microscopia padrão, é que ela permite o monitoramento da dinâmica de proteínas, do comportamento celular e do desenvolvimento de células individuais ao longo do tempo, demonstrando o procedimento que será realizado por Cone, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para preparar b tuus, inocular células a partir de estoques a menos 80 graus Celsius em 10 mililitros de meio para microscopia com lapso de tempo ou meio TLM em frascos erlenmeyer estéreis suplementados com antibióticos, se necessário, cultivar as células durante a noite a 30 graus Celsius e 225 RPM em um frasco erlenmeyer estéril. Na manhã seguinte, colher as células em um meio quimicamente definido pré-aquecido ou CDM sem antibióticos, cultivar as células mais sutis até a fase exponencial média, o que leva aproximadamente quatro horas. Medir a absorbância do cultivo em 600 nanômetros e diluir as células até uma absorbância aproximada a 600 de 0,035.Utilizando CDM. Esta DO garante que células individuais com espaçamento apropriado entre as células sejam depositadas na lâmina de microscopia para microscopia de lapso de tempo. Uma hora antes de as células atingirem o crescimento exponencial médio.Prepare a lâmina de microscópio limpando duas lâminas de vidro com etanol 70% e água. Remova uma das tampas plásticas de um gene frame, tomando cuidado para não desmontar a tampa plástica do outro lado da estrutura. Fixe o gene frame no centro de uma das lâminas de vidro, primeiro aderindo-o a um lado e depois guiando o restante com a unha.Utilize um micro-ondas para dissolver 150 miligramas de agarose de alta resolução e ponto de fusão baixo em 10 mililitros de CDM, garantindo que a agarose esteja completamente dissolvida para evitar fluorescência de fundo. Pipete 500 microlitros do CDM com agarose aquecido no centro do quadro genético, assegurando que toda a área, incluindo as bordas, seja totalmente coberta.Trabalhando rapidamente para evitar a secagem excessiva dos aros. Coloque a segunda lâmina de vidro sobre a moldura de gene Aros CDM preenchida, tentando evitar bolhas de ar. Coloque o conjunto na posição horizontal a quatro graus Celsius por 45 minutos para permitir que os aros solidifiquem adequadamente.Uma vez que o aros tenha solidificado cuidadosamente, deslize o vidro superior. Use uma lâmina de barbear para cortar tiras de aros com cerca de cinco milímetros de largura, nas quais as bactérias irão crescer. Um máximo de três tiras pode ser usado por lâmina, separadas por espaços de cerca de quatro milímetros em ambos os lados.Esses espaços fornecerão ar, essencial para o crescimento de Blu. Remova cuidadosamente a segunda e última cobertura plástica do quadro genético para expor o lado adesivo. Carregue células individuais em cerca de 2,5 microlitros de líquido no meio sólido, começando no topo do suporte de agros sem tocá-lo.Com a ponta da pipeta, permita que o meio se espalhe uniformemente inclinando a lâmina para cima e para baixo. Coloque uma lamínula limpa sobre o suporte do gene para fixar completamente o lamínula. Use a unha para aplicar pressão após as células terem sido carregadas.É fundamental esperar o tempo suficiente para a secagem do líquido, de modo a evitar células em movimento e crescimento em múltiplas camadas. No entanto, se as células forem secas por tempo excessivo, terão dificuldades para crescer em uma monocamada de microcolônias. Assim, o tempo necessário para secar suas lâminas depende do experimento e não pode ser mensurado.E, consequentemente, é claro que é necessário adquirir uma familiaridade com o procedimento. Para evitar problemas de foco automático durante as primeiras horas do experimento de microscopia com lapso de tempo, aqueça previamente a lâmina por uma hora a 30 graus Celsius para prepará-la para a microscopia com lapso de tempo. Aqueça previamente a câmara ambiental por pelo menos duas horas. Antes do início do experimento, selecione os filtros objetivos apropriados e o espelho dicromático de acordo com a sua configuração experimental.Para experimentos longos, certifique-se de que um filtro UV esteja posicionado entre a fonte de luz e a amostra. Além disso, se possível, bloqueie parte da luz de excitação utilizando filtros de densidade neutra para minimizar a exposição. Programe o experimento de acordo com a configuração experimental específica.É aconselhável determinar a quantidade de luz necessária para construtos específicos, bem como as configurações de foco automático para outros microscópios de lapso de tempo ou bactérias antes do experimento real. Tempos de exposição mais curtos e níveis mais baixos de luz de excitação minimizarão o desbotamento e a fototoxicidade. Utilize luz escópica para a função de foco automático. Por fim, coloque a lâmina preparada na câmara ambiental pré-aquecida do microscópio e monitore o crescimento de células individuais em uma monocamada de microcolônia a 30 graus Celsius.Um experimento de fluorescência com lapso de tempo bem-sucedido produzirá uma monocamada de microlcolônia localizada completamente dentro do campo de visão. Ao final do experimento neste filme, o campo claro está à esquerda e a fluorescência pode ser vista à direita.Aqui temos um exemplo de uma microcolônia de B Subtles na qual algumas células cresceram umas sobre as outras, dificultando o rastreamento preciso de sua linhagem e a medição correta de seus níveis de fluorescência. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como preparar com sucesso uma amostra microscópica para microscopia de lapso de tempo e como realizar uma microscopia de fluorescência em lapso de tempo. Experimente com células BACE.

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Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography

Este artigo descreve o procedimento para a preparação de uma versão marcada com fluorescência do bacteriófago lambda, infecção...

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

Fonte: Schlimpert, S. et al. Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo de S. venezuelae usando um dispositivo microfluídico. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo da bactéria Streptomyces venezuelae usando um dispositivo microfluídico para visualizar a germinação, o crescimento das hifas e a esporulação em tempo real.

Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida de Streptomyces venezuelae

Fonte: Makowski, Ł., et al. Imagem de Células Vivas do Ciclo de Vida do Predador Bacteriano Bdellovibrio bacteriovorus usando Microscopia de Fluorescência em Time-Lapse. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de fluorescência em time-lapse de Bdellovibrio bacteriovorus predando E. coli imobilizada sob uma almofada de agarose, permitindo visualização em tempo real da replicação intracelular e liberação de prole para estudar predação bacteriana e interações hospedeiro-patógeno.

Imagem em Time-Lapse de Células Vivas da Predação de Bdellovibrio bacteriovorus em E. coli

Descreve-se um método de resolução super-imaging para sondar a organização estrutural da bacteriano FtsZ-ring, um aparelho essencial para a divisão celular. Este método baseia-se em análises quantitativas de microscopia fotoativados localização (PALM) imagens e pode ser aplicado a outras proteínas do citoesqueleto bacterianas.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

Apresentado aqui é um protocolo que descreve o monitoramento do ciclo de vida completo da bactéria predatória Bdellovibrio bacteriovorus usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo em combinação com uma almofada de agarose e pratos de imagem celular.

Imagem de células vivas do ciclo de vida do predador bacteriano Bdellovibrio bacteriovorus usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo abrangente para avaliar a sobrevida de antibióticos para Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, transformando plasmídeos em P. aeruginosa e S. aureus para criar cepas repórteres e visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, por microscopia de epifluorescência de lapso de tempo.

Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

Aprenda a realizar microscopia de fluorescência em lapso de tempo automatizada para visualizar células bacterianas vivas de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae. Este método permite estudar dinâmicas de proteínas e comportamento celular em nível de célula única.

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