Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated
28 de julho de 2011
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para monitorar o comportamento de células individuais de diferentes bactérias no tempo usando automatizado de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, fornecem diretrizes como analisar as imagens de microscopia.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de células vivas durante o crescimento e a divisão por meio de microscopia de fluorescência, de modo que o efeito da história e da ancestralidade celular no desenvolvimento celular de bactérias possa ser estudado. Isso é realizado primeiramente transferindo as células de um meio líquido com concentrações relativamente altas de nutrientes para um meio líquido de privação nutricional. Em seguida, utiliza-se uma lâmina de microscopia na qual as células bacterianas crescerão formando uma microcolônia.
Prepara-se uma monocamada. Em seguida, grava-se um filme de microscopia de fluorescência com lapso de tempo. Por fim, processa-se o filme e analisam-se os dados.
Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram o desenvolvimento de uma única célula bacteriana ao longo do tempo por meio de microscopia de fluorescência com lapso de tempo. A principal vantagem desta técnica em relação a técnicas existentes, como citometria de fluxo e microscopia padrão, é que ela permite o monitoramento da dinâmica de proteínas, do comportamento celular e do desenvolvimento de células individuais ao longo do tempo, demonstrando o procedimento que será realizado por Cone, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para preparar b tuus, inocular células a partir de estoques a menos 80 graus Celsius em 10 mililitros de meio para microscopia de lapso de tempo ou meio TLM em frascos agitados estéreis, suplementados com antibióticos se necessário, cultivar as células durante a noite a 30 graus Celsius e 225 RPM em um frasco agitado estéril. Na manhã seguinte, colher as células em uma proporção de 1 para 10 em meio quimicamente definido ou CDM pré-aquecido, sem antibióticos, cultivar as células mais subtis até a fase exponencial média, o que leva aproximadamente quatro horas. Medir a absorbância do cultivo em 600 nanômetros e diluir as células até uma absorbância aproximada a 600 de 0,035.
Utilizando CDM. Esta DO garante que células individuais com espaçamento apropriado entre as células sejam depositadas na lâmina de microscopia para microscopia de lapso de tempo. Uma hora antes de as células atingirem o crescimento exponencial médio.
Prepare a lâmina de microscópio limpando duas lâminas de vidro com etanol 70% e água. Remova uma das tampas plásticas de uma câmara de gene, tomando cuidado para não desmontar a tampa plástica do outro lado da câmara. Fixe a câmara de gene no centro de uma das lâminas de vidro, primeiro aderindo-a a um lado e depois guiando o restante com a unha.
Use um micro-ondas para dissolver 150 miligramas de agarose de alta resolução e ponto de fusão baixo em 10 mililitros de CDM, garantindo que a agarose esteja completamente dissolvida para evitar fluorescência de fundo. Pipete 500 microlitros do CDM com agarose morno no centro da moldura gênica, assegurando que toda a área, incluindo as bordas, esteja completamente coberta.
Trabalhando rapidamente para evitar a secagem excessiva dos aros. Coloque a segunda lâmina de vidro sobre a moldura de gene Aros CDM preenchida, tentando evitar bolhas de ar. Coloque o conjunto em posição horizontal a quatro graus Celsius por 45 minutos para permitir que os aros solidifiquem suficientemente.
Uma vez que o aros tenha solidificado cuidadosamente, deslize o vidro superior. Use uma lâmina de barbear para cortar tiras de aros com cerca de cinco milímetros de largura, nas quais as bactérias irão crescer. Um máximo de três tiras pode ser usado por lâmina, separadas por espaços de cerca de quatro milímetros em ambos os lados.
Esses espaços fornecerão ar, essencial para o crescimento de Blu. Remova cuidadosamente a segunda e última cobertura plástica do quadro genético para expor o lado adesivo. Carregue células individuais em cerca de 2,5 microlitros de líquido sobre o meio sólido, começando no topo do suporte de agros sem tocá-lo.
Com a ponta da pipeta, permita que o meio se espalhe uniformemente inclinando a lâmina para cima e para baixo. Coloque uma lamínula limpa sobre o suporte do gene para fixar completamente o lamínula. Use a unha para aplicar pressão após as células terem sido carregadas.
É fundamental esperar o tempo suficiente para a secagem do líquido, de modo que você não obtenha células nadando nem crescimento em múltiplas camadas. No entanto, se as células forem secas por tempo excessivo, terão dificuldades para crescer em uma monocamada de microcolônias. Assim, o tempo necessário para secar suas lâminas depende do experimento e não pode ser mensurado.
E, consequentemente, é claro que é necessário adquirir uma sensação prática sobre isso. Para evitar problemas de foco automático durante as primeiras horas do experimento de microscopia com lapso de tempo, aqueça previamente a lâmina por uma hora a 30 graus Celsius para prepará-la para a microscopia com lapso de tempo. Aqueça previamente a câmara ambiental por pelo menos duas horas. Antes do início do experimento, selecione o objetivo apropriado, os filtros e o espelho dicróico de acordo com a sua configuração experimental.
Para experimentos longos, certifique-se de que um filtro UV esteja posicionado entre a fonte de luz e a amostra. Além disso, se possível, bloqueie parte da luz de excitação utilizando filtros de densidade neutra para minimizar a exposição. Programe o experimento de acordo com a configuração experimental específica.
É aconselhável determinar a quantidade de luz necessária para construtos específicos, bem como as configurações de foco automático para outros microscópios de lapso de tempo ou bactérias antes do experimento real. Tempos de exposição mais curtos e níveis mais baixos de luz de excitação minimizarão o desbotamento e a fototoxicidade. Utilize luz scópica para a função de foco automático. Por fim, coloque a lâmina preparada na câmara ambiental pré-aquecida do microscópio e monitore o crescimento de células individuais em uma monocamada de microcolônia a 30 graus Celsius.
Um experimento de fluorescência com lapso de tempo bem-sucedido produzirá uma monocamada de microlcolônia localizada completamente dentro do campo de visão. Ao final do experimento neste filme, o campo claro está à esquerda e a fluorescência pode ser vista à direita.
Aqui temos um exemplo de uma microcolônia de B Subtles na qual algumas células cresceram umas sobre as outras, dificultando o rastreamento preciso de sua linhagem e a medição correta de seus níveis de fluorescência. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como preparar com sucesso uma amostra microscópica para microscopia de lapso de tempo e como realizar uma microscopia de fluorescência em lapso de tempo. Experimente com células BACE.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para monitorar o comportamento de células bacterianas individuais ao longo do tempo utilizando microscopia automatizada de fluorescência com intervalo de tempo. Inclui diretrizes detalhadas para preparar amostras e analisar as imagens resultantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Celular
- Microscopia de Fluorescência
Contexto
- Compreender o comportamento da célula bacteriana é fundamental para diversos estudos biológicos.
- A microscopia com lapso de tempo permite a observação da dinâmica de células vivas.
- Este método fornece informações sobre os efeitos da história celular no desenvolvimento.
- Os métodos tradicionais podem não captar as nuances do comportamento de células individuais.
Objetivo do Estudo
- Visualizar células bacterianas vivas durante o crescimento e a divisão.
- Analisar o impacto das condições nutricionais no desenvolvimento celular.
- Aprimorar a compreensão da dinâmica de proteínas e do comportamento celular.
Métodos Utilizados
- Transfira as células para meio de inanição para iniciar o crescimento.
- Prepare uma lâmina de microscópio para o crescimento bacteriano.
- Registre filmes de microscopia de fluorescência com lapso de tempo.
- Analise os dados registrados para observar o desenvolvimento celular.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de células bacterianas individuais ao longo do tempo.
- Observação da formação e desenvolvimento de microcolônias.
- Compreensão da dinâmica da expressão proteica em células individuais.
- Demonstração das vantagens da microscopia com lapso de tempo em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- O protocolo permite efetivamente o estudo do comportamento de células individuais em bactérias.
- A microscopia com lapso de tempo é uma ferramenta poderosa para análise celular.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar outras dinâmicas bacterianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O monitoramento do comportamento de células individuais em bactérias permite a desmistificação mecanicista da validação de alvos antimicrobianos, revelando heterogeneidade no crescimento, divisão e expressão proteica. Essa abordagem sustenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao vincular a história celular aos desfechos fenotípicos, orientando a triagem de portfólios para o desenvolvimento de antibióticos. A microscopia com intervalo de tempo proporciona continuidade translacional, desde a triagem mecanicista até a avaliação em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio do acompanhamento das respostas individuais das células a alterações nutricionais e perturbações genéticas ao longo do tempo.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta da dinâmica proteica e do comportamento celular em células individuais.
- Valor Preditivo: Apoia a identificação de compostos promissores ao correlacionar a linhagem celular com a estabilidade fenotípica ao longo das gerações.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, estabelecendo a formação reprodutível de microcolônias em lâminas de agarose.
- Saídas Quantitativas: Gera dados de fluorescência e campo claro com resolução temporal, permitindo a medição de taxas de crescimento, tempo de divisão e localização proteica.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes espécies bacterianas (B. subtilis, S. pneumoniae) para avaliação padronizada de alvos antimicrobianos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela o comportamento de patógenos em espécies clinicamente relevantes, como S. pneumoniae, para orientar estudos sobre o mecanismo de ação de antimicrobianos.
- Alinhamento de Biomarcadores Translacionais: Relaciona a dinâmica proteica em nível de célula única com fenótipos em nível populacional, apoiando decisões de avanço ou interrupção baseadas em biomarcadores.
- Progressão Ajustada ao Risco: Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos pré-clínicos ao validar os efeitos sobre o alvo com resolução em nível de célula única.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método posiciona a imagem de lapso de tempo de célula única entre a validação de alvos e a otimização de compostos iniciais, permitindo a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao visualizar como a dinâmica da expressão gênica influencia o comportamento celular durante o crescimento e a divisão.
- Triagem: Fornece microcolônias prontas para ensaios, com espaçamento padronizado e formação de monocamada, para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Oferece variáveis dependentes quantitativas, incluindo intensidade de fluorescência, tempo de divisão e rastreamento de linhagem, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta observações em nível de célula única à continuidade pré-clínica por meio de modelagem de comportamento dependente da ancestralidade em sistemas patogênicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de microscopia reutilizável para avaliação de alvos antimicrobianos em projetos múltiplos, utilizando modelos Gram-positivos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da observação direta da dinâmica proteica em única célula e da heterogeneidade comportamental.
- Valor Operacional: Preparação padronizada de lâminas e controles ambientais garantem reprodutibilidade entre laboratórios e execuções experimentais.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar ou interromper projeto aprimoradas mediante redução de riscos com base na consistência da resposta em única célula, em vez de médias populacionais.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos antimicrobianos utilizando dados fenotípicos resolvidos por linhagem para evitar falsos positivos decorrentes da máscara populacional.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas de cultivo microbiano, microscopia de fluorescência e software de análise de imagens, como o ImageJ.
- Depende de câmaras ambientais com controle de temperatura, filtros de densidade neutra e proteção contra UV para imagens de longa duração.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação de lâminas, concentração de agarose e carregamento celular para garantir consistência entre laboratórios.
- As considerações para adaptação incluem a otimização da espessura da agarose e da composição nutricional para diferentes espécies bacterianas e taxas de crescimento.
- As limitações práticas incluem os riscos de fototoxicidade durante imagens prolongadas e as dificuldades no rastreamento de células que crescem em formações multicamadas.
