Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de células vivas por meio de crescimento e divisão usando microscopia de fluorescência para que o efeito da história celular e ancestralidade no desenvolvimento celular de bactérias possa ser estudado. Isso é feito primeiro transferindo as células do meio líquido com concentrações relativamente altas de nutrientes para o meio de privação de líquido. Em seguida, uma lâmina microscópica na qual as células bacterianas se transformarão em uma microcolônia.

A monocamada é preparada. Em seguida, um filme de microscopia de fluorescência com lapso de tempo é gravado. Por fim, o filme é processado e os dados são analisados.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o desenvolvimento de uma única célula bacteriana por meio de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. A principal vantagem desta técnica sobre as técnicas existentes, como citometria de fluxo e microscopia padrão, é que ela permite o monitoramento da dinâmica da proteína, comportamento celular e desenvolvimento de células individuais no tempo, demonstrando que o procedimento será em cone, um estudante de doutorado do meu laboratório Para preparar b tuus inocular células de menos 80 graus Celsius, estoques em 10 mililitros de microscopia de lapso de tempo ou meio TLM em frascos de agitação estéreis suplementados com antibióticos, se necessário, cultive as células durante a noite a 30 graus Celsius e 225 RPM em um frasco de agitação estéril na manhã seguinte para saquear as células de um a 10 em meio pré-aquecido, quimicamente definido ou MDL sem antibióticos, cultive as células mais sutis da abelha para a fase exponencial média, que leva aproximadamente quatro horas. Meça a absorbância da cultura em 600 nanômetros e dilua as células para aproximadamente 600 de 0,035.

Usando o CDM. Este OD garante que células individuais com espaçamento apropriado entre as células sejam localizadas na lâmina do microscópio para microscopia de lapso de tempo. Uma hora antes de as células atingirem o crescimento exponencial médio.

Prepare a lâmina do microscópio limpando duas lâminas de vidro com etanol 70% e água. Remova uma das tampas plásticas de uma moldura genética, tomando cuidado para não causar a desmontagem da tampa plástica do outro lado da moldura. Prenda a moldura do gene no meio de uma das lâminas de vidro, primeiro colando-a de um lado e, em seguida, guiando o resto com a unha.

Use um micro-ondas para dissolver 150 miligramas de aros de alta resolução e baixo ponto de fusão. Em 10 mililitros de MDL, certifique-se de que o aros esteja totalmente dissolvido para evitar a fluorescência de fundo. Pipete 500 microlitros do agro CDM quente no meio do quadro genético, certificando-se de que toda a área, incluindo as bordas, esteja totalmente coberta.

Trabalhando rapidamente para evitar o ressecamento excessivo do aros. Coloque a segunda lâmina de vidro na estrutura do gene preenchido com CDM Aros tentando evitar bolhas de ar. Coloque o sanduíche na posição horizontal a quatro graus Celsius por 45 minutos para permitir que os agros solidifiquem o suficiente.

Assim que o aros solidificar cuidadosamente, deslize o vidro superior. Use uma lâmina de barbear para cortar tiras agrícolas de cerca de cinco milímetros de largura nas quais as bactérias crescerão. Um máximo de três tiras podem ser usadas por lâmina, separadas por espaços de cerca de quatro milímetros de cada lado.

Esses espaços fornecerão ar essencial para o crescimento do Blu. Remova cuidadosamente a segunda e última tampa de plástico da estrutura do gene para expor o lado adesivo. Carregue células individuais em cerca de 2,5 microlitros de líquido no meio sólido, começando no topo da almofada agros sem tocá-la.

Com a ponta da pipeta, deixe o meio espalhar-se uniformemente, inclinando a corrediça para cima e para baixo. Coloque uma tampa de microscópio limpa na estrutura do gene para prender completamente a lamínula. Use uma unha para aplicar pressão Então, depois que as células forem carregadas.

É crucial esperar que o líquido seque por tempo suficiente para que você não tenha células natatórias e crescimento em várias camadas. No entanto, se as células ficarem secas por muito tempo, elas terão problemas para crescer em uma microcamada de colão. Portanto, o tempo necessário para secar suas lâminas depende do experimento e não pode ser medido.

E, conseqüentemente, é claro que é preciso ter uma ideia: para evitar problemas de foco automático durante as primeiras horas do experimento de lapso de tempo, pré-aqueça a lâmina por uma hora a 30 graus Celsius para se preparar para a microscopia de lapso de tempo. Pré-aqueça a câmara ambiental por pelo menos duas horas. Antes do início do experimento, selecione os filtros de objetiva e o espelho dicróico apropriados de acordo com sua configuração experimental.

Para experimentos longos, certifique-se de que um filtro UV seja colocado entre a fonte de luz e a amostra. Além disso, se possível, bloqueie parte da luz de excitação usando filtros de densidade neutra para minimizar a exposição. Programe o experimento de acordo com a configuração experimental específica.

É aconselhável determinar a quantidade de luz necessária para construções específicas, bem como as configurações de foco automático para outros microscópios de lapso de tempo ou bactérias antes do experimento real. Tempos de exposição mais curtos e níveis mais baixos de luz de excitação minimizarão o branqueamento e a fototoxicidade Use luz scópica para a função de foco automático. Finalmente, coloque a lâmina preparada na câmara ambiental pré-aquecida do microscópio e monitore o crescimento de células individuais em uma monocamada de microcolônia a 30 graus Celsius.

Um experimento de fluorescência de lapso de tempo bem-sucedido produzirá uma monocamada de microcolônia completamente localizada dentro do campo de visão. No final do experimento neste filme, o campo brilhante está à esquerda e a fluorescência pode ser vista. À direita.

Aqui está um exemplo de uma microcolônia B Subtles na qual algumas células cresceram umas sobre as outras, dificultando o rastreamento de sua história com precisão, bem como a medição correta de seus níveis de fluorescência. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar com sucesso uma amostra microscópica para microscopia de lapso de tempo e como realizar uma microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Experimente com células BACE.