Detecção de modificações de histonas em células de levedura com superexpressão de proteínas neurodegenerativas

Comece com uma suspensão de células de levedura superexpressando proteínas ligadas a doenças neurodegenerativas.

Esta proteína superexpressa é responsável por modificações nas proteínas de empacotamento de DNA ou histonas com porções químicas.

Adicione hidróxido de sódio e beta-mercaptoetanol e depois incube no gelo.

O hidróxido de sódio e o beta-mercaptoetanol lisam as células, liberando as proteínas intracelulares, incluindo histonas.

Centrifugue o lisado para coletar as proteínas. Descarte o sobrenadante.

Adicione um corante de carregamento ao pellet de proteína e aqueça-o para desnaturá-los.

Carregue essas proteínas desnaturadas e um marcador de proteína no gel e na eletroforese para separá-las por tamanho.

Eletrotransfira as proteínas para uma membrana, lave e adicione um tampão de bloqueio para evitar a ligação não específica.

Adicione anticorpos primários que se ligam especificamente a histonas modificadas.

Lave para remover anticorpos não ligados e incube com anticorpos secundários fluorescentes, que se ligam aos anticorpos primários.

Uma banda fluorescente distinta confirma modificações de histonas, indicando superexpressão de proteínas neurodegenerativas.

Para lisar as células par