Detecção de modificações de histonas em células de levedura com superexpressão de proteínas neurodegenerativas

Comece com uma suspensão de células de levedura superexpressando proteínas ligadas a doenças neurodegenerativas.

Esta proteína superexpressa é responsável por modificações nas proteínas de empacotamento de DNA ou histonas com porções químicas.

Adicione hidróxido de sódio e beta-mercaptoetanol e depois incube no gelo.

O hidróxido de sódio e o beta-mercaptoetanol lisam as células, liberando as proteínas intracelulares, incluindo histonas.

Centrifugue o lisado para coletar as proteínas. Descarte o sobrenadante.

Adicione um corante de carregamento ao pellet de proteína e aqueça-o para desnaturá-los.

Carregue essas proteínas desnaturadas e um marcador de proteína no gel e na eletroforese para separá-las por tamanho.

Eletrotransfira as proteínas para uma membrana, lave e adicione um tampão de bloqueio para evitar a ligação não específica.

Adicione anticorpos primários que se ligam especificamente a histonas modificadas.

Lave para remover anticorpos não ligados e incube com anticorpos secundários fluorescentes, que se ligam aos anticorpos primários.

Uma banda fluorescente distinta confirma modificações de histonas, indicando superexpressão de proteínas neurodegenerativas.

Para lisar as células para análise de western blot, descongele os grânulos de células de levedura em gelo antes da ressuspensão em 100 microlitros de água destilada. Adicione 300 microlitros de hidróxido de sódio 0,2 molar e 20 microlitros de 2-mercaptoetanol a cada amostra de célula. E ressuspenda os pellets pipetando.

Após uma incubação de 10 minutos no gelo, pelete as células por centrifugação e ressuspenda as amostras em 100 microlitros de corante de carga. Em seguida, ferva as amostras por 10 minutos em um bloco de aquecimento. Enquanto as amostras estão sendo lisadas, coloque dois géis em um suporte de gel e encha a câmara interna até o topo com tampão corrido e a câmara externa até a marca da linha de dois géis.

Quando as amostras estiverem prontas, carregue 15 microlitros de cada solução de lise celular em cada poço do gel de poliacrilamida a 10% de 10 poços e adicione 5 microlitros de escada de proteína ao poço da pista da escada de proteína. Execute o gel por aproximadamente 45 minutos a 150 volts ou até que a frente do corante de carregamento atinja o fundo do gel.

Enquanto o gel estiver funcionando, mergulhe duas almofadas de fibra por gel em tampão de transferência e uma membrana de fluoreto de polivinilideno ou PVDF por gel em metanol. Quando o gel estiver pronto, enxágue a membrana e transfira o tampão. E coloque uma almofada de fibra pré-embebida na parte inferior de uma célula de aparelho de transferência semi-seca, seguida pela membrana de PVDF, o gel e a segunda almofada de fibra pré-embebida.

Em seguida, defina a potência para 150 miliamperes por 1 hora. No final da transferência de proteínas, remova a membrana do aparelho de transferência para um breve enxágue com água destilada. Coloque a proteína da membrana enxaguada para cima em uma pequena caixa de coloração e cubra a membrana com solução salina tamponada com Tris ou tampão bloqueador de TBS por uma incubação de 1 hora em temperatura ambiente com balanço suave.

No final da incubação de bloqueio, incubar a membrana durante a noite com uma histona antifúngica e um anticorpo específico de modificação em TBS a 4 graus Celsius e um anticorpo de controle de carga nuclear adequado.

Na manhã seguinte, lave a membrana quatro vezes em TBS, suplementada com 0,1% de polissorbato 20 por cinco minutos com balanço em temperatura ambiente por lavagem. Após a última lavagem, incube o blot com os anticorpos secundários apropriados por 1 hora em temperatura ambiente, seguido por quatro lavagens de 5 minutos em TBST e uma lavagem de cinco minutos apenas em TBS com balanço.

Em seguida, imagine a mancha em um sistema de imagem fluorescente de western blot por 2 minutos.