Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:37 min. • April 28th, 2025
Comece com o tecido cerebral de um camundongo transgênico superexpressando α-sinucleína mutada, uma proteína neuronal mal dobrada associada a doenças neurodegenerativas, imersa em um tampão com alto teor de sal.
Homogeneizar o tecido com um pilão grande, seguido de um pilão pequeno para romper o tecido e liberar proteínas intracelulares, incluindo α-sinucleína.
Transferir o homogeneizado para um tubo e centrifugar. Colete o sobrenadante contendo proteínas e dilua-o com um tampão.
Adicione este sobrenadante a uma microplaca revestida com anticorpos específicos de α-sinucleína pré-tratada com um agente bloqueador para evitar a ligação inespecífica.
Incubar com agitação, permitindo que a α-sinucleína normal e mutada se ligue.
Lave a placa, adicione anticorpos de detecção específicos para α-sinucleína mutada e incube com agitação.
Lave novamente e adicione anticorpos ligados a enzimas, seguido de incubação sob agitação.
Adicione substrato e incube no escuro sob agitação. O substrato reage com a enzima para produzir uma mudança de cor.
Pare a reação com um ácido e meça a absorbância para quantificar a α-sinucleína mutada.
Para preparar homogeneizados cerebrais, adicione um volume adequado de tampão HS às regiões cerebrais dissecadas para atingir uma porcentagem esperada de homogeneizado, conforme mostrado na tabela abaixo. Usando um moedor de tecido composto de tubo de vidro de borossilicato e dois pilões, A e B, despeje uma região do cérebro para ser esmagada no tubo. E então com o pilão A, homogeneizar o tecido 10 vezes para dissociá-lo.
Em seguida, mude para o pilão B e homogeneize mais 20 vezes. Com uma pipeta de transferência, transfira o homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitros, repetindo a homogeneização com as amostras cerebrais restantes. Centrifugue as amostras a 1.000 g por cinco minutos, a quatro graus Celsius. Em seguida, colete os sobrenadantes e divida-os em alíquotas de 200 microlitros.
Com 100 microlitros da solução de revestimento de anticorpos, cubra os poços de microplacas de 96 poços e incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione 300 microlitros de PBST aos poços e use uma lavadora de placas para lavar as placas cinco vezes. Enquanto trabalha em temperatura ambiente, avançando, adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio T20 PBS a cada poço e agite as placas a 150 RPM por uma hora antes de usar PBST para lavar as placas cinco vezes.
Usando PBST, 1% de BSA, dilua os homogeneizados cerebrais usando as diretrizes listadas aqui. E adicione 100 microlitros a cada poço. Em seguida, incube em temperatura ambiente e 150 RPM por duas horas antes de usar PBST para lavar as placas cinco vezes.
Após a lavagem final, adicione os anticorpos de detecção de alfa-sinucleína necessários diluídos em PBST e 1% de BSA, conforme listado na tabela dois do protocolo de texto. Incube em temperatura ambiente e 150 RPM por uma hora antes de lavar as placas cinco vezes como antes.
Em seguida, adicione conjugados IGG HRP anti-rato ou anti-coelho diluídos de 1 a 8.000 em PBST, 1% BSA. E incube a 150 RPM por uma hora antes de lavar as placas cinco vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução TMB a cada poço e incube a 150 RPM por 15 minutos no escuro. Pare a reação adicionando 100 microlitros de um ácido clorídrico normal por poço. Em seguida, use um leitor de microplacas para medir a absorbância em 450 nanômetros.