Detecção de proteína associada a doenças neurodegenerativas α-sinucleína usando ELISA

Comece com o tecido cerebral de um camundongo transgênico superexpressando α-sinucleína mutada, uma proteína neuronal mal dobrada associada a doenças neurodegenerativas, imersa em um tampão com alto teor de sal.

Homogeneizar o tecido com um pilão grande, seguido de um pilão pequeno para romper o tecido e liberar proteínas intracelulares, incluindo α-sinucleína.

Transferir o homogeneizado para um tubo e centrifugar. Colete o sobrenadante contendo proteínas e dilua-o com um tampão.

Adicione este sobrenadante a uma microplaca revestida com anticorpos específicos de α-sinucleína pré-tratada com um agente bloqueador para evitar a ligação inespecífica.

Incubar com agitação, permitindo que a α-sinucleína normal e mutada se ligue.

Lave a placa, adicione anticorpos de detecção específicos para α-sinucleína mutada e incube com agitação.

Lave novamente e adicione anticorpos ligados a enzimas, seguido de incubação sob agitação.

Adicione substrato e incube no escuro sob agitação. O substrato reage com a enzima para produzir uma mudança de cor.

Pare a reação com um ácido e meça a absorbância para quantificar a α-sinucleína mutada.

Para preparar homogeneizados cerebrais, adicione um volume adequado de ta