Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Este vídeo demonstra um procedimento para separar conjuntos virais mistos com base em sua composição de ácido nucleico. Isso permite o estudo da diversidade taxonômica e do potencial funcional de assembleias virais complexas. Aqui, a hidroxiapatita, uma forma cristalina de fosfato de cálcio, é empregada na separação de ácidos nucléicos.

Primeiro, uma coluna de hidroxiapatita é embalada e ácidos nucléicos virais purificados equilibrados são então aplicados à coluna, a interação de carga entre os íons de cálcio carregados positivamente da hidroxiapatita e a estrutura de fosfato carregada negativamente dos subtipos de ácidos nucléicos liga os ácidos nucléicos à coluna Nick. Em seguida, o DNA de fita simples, D-N-A-R-N-A e fita dupla são aludidos sequencialmente com diferentes concentrações de tampão fosfato. Os ácidos nucléicos resultantes são então dessalinizados e concentrados em preparação para visualização, quantificação e identificação por sequenciamento de DNA A eletroforese em gel agros confirma que as espécies de ácidos nucléicos podem ser separadas com menos de 9% de transferência.

Assim, esse método permite avaliar a diversidade e a capacidade funcional das comunidades virais. Olá, meu nome é Doug Fro e sou pesquisador associado no laboratório da Dra. Shannon Williamson no j Craig Venture Institute. Hoje mostrarei a vocês um procedimento para separar DNA de fita simples, DNA de fita dupla e RNA de um conjunto viral ambiental.

Este método tem vantagens sobre os métodos existentes, como o tratamento com o núcleo, que tem como alvo o DNA ou o RNA. A cromatografia de hidroxiapatita tem a capacidade de capturar toda a comunidade viral. Este método nos permite responder a várias perguntas no campo da ecologia viral.

Por exemplo, qual é o complemento genético total ou a diversidade da comunidade viral? Pensamos nesse método pela primeira vez quando queríamos estudar todas as assembléias de plâncton do Rio da Baía de Chesapeake sem sacrificar um subconjunto da assinatura genética. As soluções necessárias para este experimento devem ser preparadas com antecedência de acordo com as instruções do protocolo escrito que acompanha e incluem tampão fosfato molar 0,12, tampão fosfato molar 0,20, tampão fosfato molar 0,40 e uma solução molar de fosfato.

Todos em pH 6,8 e hidroxiapatita hidratada no dia do experimento, equilibram todos os tampões de fosfato e hidroxiapatita hidratada, colocando-os em banho-maria a 60 graus Celsius. Comece este procedimento preparando a coluna econo que será usada para a separação dos ácidos nucléicos virais. Fixe uma torneira na extremidade da coluna econo e certifique-se de que está fechada.

Usando um pipetador, adicione água deionizada à coluna, coloque a tampa no topo da coluna e inverta repetidamente a coluna para enxaguá-la. Despeje a água e repita esta lavagem várias vezes. Em seguida, remova a torneira de parada da coluna econômica e autoclave-a para esterilizá-la.

A torneira de parada não é autoclave, pois derrete. Enxágue a torneira de parada com água ionizada e, em seguida, novamente com etanol a 70% e deixe secar ao ar após a autoclavagem. Substitua a torneira de parada e feche-a.

Em seguida, trabalhando em uma capela de exaustão, adicione um mililitro de revestimento sigma à coluna e cubra o vidro da coluna invertendo a coluna com um movimento de rolamento, conforme mostrado aqui. O revestimento com uma camada sigma minimizará a aderência dos ácidos nucléicos à superfície do vidro. Durante a separação, uma superfície de vidro de sal foi revestida.

Abra a torneira de parada e transvase em um tubo cônico. Em seguida, para conectar a coluna a um banho-maria circulante, use dois grampos para prender a coluna a um suporte de anel. Conecte o tubo de silicone do banho-maria circulante, de modo que o fluxo da água do banho-maria seja de baixo para cima.

Defina a temperatura para 60 graus Celsius e inicie a circulação. Na prática, a coluna e a tubulação seriam envolvidas em um agente isolante, como folha de alumínio ou isolamento de tubo de espuma. Para minimizar a perda de calor, esta etapa não é mostrada aqui.

Para melhor visualizar o procedimento, feche a torneira de parada. Usando um pipetador, adicione 10 mililitros de água livre de RNAs estéreis. Abra a torneira de parada e deixe a água escorrer.

Em seguida, lave novamente após a segunda lavagem. Enxágüe duas vezes com 10 mililitros de tampão fosfato molar 0,12 molar livre de RNAs estéreis e transvase entre as lavagens. A coluna está agora pronta para cromatografia de hidroxiapatita.

Certifique-se de que a torneira de parada da coluna econômica esteja fechada. Em seguida, usando uma pipeta sorológica estéril de dois mililitros, adicione lentamente dois mililitros de apetite hidroxi reidratado ressuspenso preparado na parte inferior da coluna. Recoloque a tampa da coluna.

Deixe o apetite hidroxi assentar sob a força da gravidade por 30 minutos. Este método requer atenção aos detalhes. A coluna de apetite hidroxi processa a uma taxa de 0,25 a 0,5 mils por minuto.

Por isso, é muito importante ficar de olho na coluna para que ela não seque. Após 30 minutos, abra a torneira de parada para drenar o tampão para um recipiente de resíduos. Feche a torneira de parada e descarte o fluxo.

Combine ácidos nucléicos com tampão fosfato molar 0,12 em um volume final de 500 microlitros e incube a 60 graus Celsius por 10 minutos. Isso equilibrará os ácidos nucléicos à temperatura da coluna e aumentará a separação das diferentes espécies de ácidos nucléicos, removendo quaisquer estruturas secundárias que possam estar presentes. Usando uma pipeta sorológica de dois mililitros, aplique rapidamente a solução de ácido nucleico no apetite hidroxilado, tomando cuidado para não perturbar a coluna.

Uma vez que todos os 500 microlitros fluem para a coluna, uma pequena quantidade de tampão fosfato molar de 0,12 pode ser adicionada ao topo da coluna para evitar que ela seque. Deixe os ácidos nucléicos se ligarem ao apetite hidroxi por 30 minutos. Após a incubação de ligação, coloque um tubo cônico de 15 mililitros sob a coluna.

Em seguida, abra a torneira de parada e colete a amostra inicial de 500 microlitros, que contém DNA de fita simples. Depois de coletar 500 microlitros, feche a torneira de parada. Em seguida, adicione seis mililitros de tampão fosfato molar 0,12 ao apetite hidroxi, certificando-se de não perturbar a coluna.

Em seguida, abra a torneira de parada e continue a coletar o fluxo contendo DNA de fita singlete no mesmo tubo de 15 mililitros da etapa anterior. Após a coleta de aproximadamente seis mililitros, feche a torneira. Adicionar um volume de uma solução de álcool isoamílico de fenol-clorofórmio ao tubo misturado vigorosamente por vórtice e, em seguida, centrifugar a 3 500 vezes G durante 15 minutos.

Após a centrifugação, o tubo conterá duas camadas. Transfira a camada superior de aquiescência, que contém a fita única de DNA para um novo tubo de 15 mililitros, e armazene a amostra em temperatura ambiente para eluir e purificar o RNA Da coluna, adicione seis mililitros de tampão fosfato 0,20 molar e colete o fluxo antes de usar um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, faça uma extração de fenol clorofórmio.

Quanto à amostra de DNA de fita simples, repita esse processo usando seis mililitros de tampão fosfato molar 0,40 para eluir e purificar o DNA de fita dupla da coluna. Finalmente, para retirar a coluna de qualquer DNA residual de fita dupla. Repita esse processo mais uma vez.

Desta vez, usando seis mililitros de tampão fosfato molar 1,00 para dessalinizar as amostras de ácido nucleico. Transfira de quatro a cinco mililitros de cada amostra para um dispositivo de filtro centrífugo Ultra quatro equipado com uma amostra de concentrado de membrana ultracelular de corte de peso molecular de 30.000 para menos de 500 microlitros, girando a 6.000 GS a 30 graus Celsius por cerca de cinco minutos em um rotor de ângulo fixo. Depois de descartar o fluxo, adicione o restante das amostras ao filtro.

Aumente o volume para quatro a cinco mililitros com um tampão XTE livre de RNAs. Em seguida, gire novamente até obter um volume concentrado. Cerca de cinco minutos após a centrifugação, adicione quatro a cinco mililitros de RNAs, libere um tampão XTE ao filtro e concentre-se.

Novamente, repita esta lavagem e mais cinco vezes para dessalinizar completamente as amostras de ácido nucleico. Uma vez que as amostras tenham sido completamente concentradas e dessalinizadas, transfira as amostras de ácido nucleico restantes para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mililitro. Precipite os ácidos nucléicos adicionando um décimo do volume de acetato de sódio, dois volumes de etanol 100% e um microlitro de azul de glico bem misturado por centrífuga de vórtice.

A 28.000 GS quatro graus Celsius. 60 minutos para Kent. Certificando-se de não perturbar o pellet.

Adicione 300 microlitros de rotação de etanol a 70% à temperatura ambiente de 28.000 GS por 10 minutos para não secar e ressuspender cada fração em um volume apropriado de RNAs. Tampão TE livre concentrações iguais dos ácidos nucléicos virais M 13 MP 18, DNA de fita simples MS duas fitas simples, RNA FI seis fita dupla, RNA e DNA lambda de fita dupla foram combinados e, em seguida, separados usando cromatografia de hidroxiapatita, conforme mostrado neste vídeo. Concentrações iguais de M 13, MP 18, DNA de fita simples, MS dois, fita simples, RNA cinco, seis fita dupla, RNA e DNA de fita dupla Lambda foram combinadas, conforme mostrado na pista seis, e aplicadas a uma coluna de hidroxiapatita, como pode ser visto aqui.

D-N-A-R-N-A de fita simples e DNA de fita dupla foram aludidos independentemente da coluna de hidroxiapatita usando tampão fosfato 0,12 molar, 0,18 molar, 0,40 molar e 1,00 molar. Uma escada de um KB foi usada para confirmar o tamanho do genoma. Esses resultados indicam que este método pode ser usado para separar com sucesso o DNA de fita simples, DNA de fita dupla e RNA com menos de 9% de transferência de uma fração para a próxima.

Este método também foi usado para separar ácidos nucléicos isolados de uma comunidade viral na Baía de Chesapeake, como mostrado aqui. D-N-A-R-N-A de fita simples e DNA de fita dupla foram aludidos independentemente usando concentrações de tampão fosfato de 0,12 molar, 0,20 molar e 0,40 molar, ou 1,00 molar, respectivamente, escada de DNA de alta massa na pista um e uma escada KB na pista dois foram usadas para confirmar visualmente o peso molecular aproximado e a massa de ácidos nucléicos, como pode ser visto aqui, o DNA de fita dupla foi o tipo de ácido nucléico dominante extraído do plâncton Verio da Baía de Chesapeake. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como separar ácidos nucléicos de um conjunto viral misto usando cromatografia de hidroxiapatita.

Isso inclui a preparação da coluna de hidroxiapatita e ácidos nucléicos, a separação e ilusão de ácidos nucléicos usando várias concentrações de tampão fosfato e dessalinização e concentração dos ácidos nucléicos após a separação.