Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:01 min. • April 28th, 2025
Pegue um rato de controle anestesiado e um modelo de rato com lesão cerebral induzida por laser.
A aplicação de laser no hemisfério direito danificou as células e a barreira hematoencefálica, ou BBB, que separa o sangue do tecido cerebral.
Injete um corante de rastreamento na veia da cauda canulada que viaja pela circulação sistêmica para chegar ao cérebro.
O corante se liga às proteínas plasmáticas e vaza para o tecido cerebral através da BBB danificada.
Eutanasiar os ratos.
Perfunda os ratos através do coração para limpar o corante da circulação.
Extraia e corte o cérebro, isole as fatias do hemisfério lesionado e homogeneize-as.
Trate com uma solução ácida para desnaturar as proteínas, liberando o corante ligado às proteínas.
Centrifugue e isole o sobrenadante contendo corante. Adicione álcool para aumentar a fluorescência do corante.
Transfira a solução para uma microplaca. Após a excitação, uma intensidade de fluorescência mais alta no cérebro lesionado indica dano BBB induzido por laser.
Para avaliar a incidência de quebra da barreira hematoencefálica, 24 horas após a lesão induzida pelo laser, carregar uma seringa com corante azul de Evans a 2%, diluído em 4 mililitros por quilograma de solução salina, e administrar a solução por via intravenosa aos ratos lesados e controle através da veia caudal canulada.
Deixe a solução circular por uma hora, antes de usar conjuntos de pinos cirúrgicos e tesouras para abrir o peito do primeiro animal. Perfundir o coração exposto, com soro fisiológico a 0,9% resfriado pelo ventrículo esquerdo a 110 milímetros de mercúrio de pressão, até que um líquido de perfusão incolor seja observado do átrio direito.
Em seguida, colha o cérebro e obtenha fatias rostrocaudal de 2 milímetros. Separe as fatias do cérebro esquerdo das fatias do cérebro direito para permitir a avaliação dos hemisférios lesionados e não lesionados separadamente e pese as amostras. Homogeneizar as amostras, usando um almofariz e pilão, e incubar as amostras de tecido em ácido tricloroacético a 50% por 24 horas.
No dia seguinte, centrifugou as amostras de tecido cerebral homogeneizado, por 20 minutos a 10.000 vezes g e temperatura ambiente. Misture 1 mililitro do sobrenadante com 1,5 mililitros de etanol a 96% na proporção de 1 para 3. Em seguida, use um detector de fluorescência com excitação de 620 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 680 nanômetros para avaliar a quebra da barreira hematoencefálica.