Quantificação e análise da formação de HO-endonuclease Stimulated translocações cromossômicas por Strand Único Annealing em Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral deste procedimento é determinar o controle genético da formação de translocação por ajoelhado de fita simples em células de levedura diploides em brotamento. Isso é feito primeiro inoculando culturas com colônias únicas de um genótipo específico e cultivando-as durante a noite. A segunda etapa do procedimento é induzir a formação simultânea de quebra de fita dupla por endonuclease ho em dois cromossomos pela adição de galactose às culturas.

Em seguida, a diluição dessas culturas é semeada em meios seletivos e não seletivos. A etapa final é determinar a frequência de translocação contando as colônias que surgem em meios seletivos e não seletivos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o controle genético da formação de translocação por fita simples, um ajoelhar-se através de mudanças na frequência de formação de translocação estimulada em cepas de diferentes genótipos.

As implicações desta técnica se estendem às consequências da exposição terapêutica à radiação de pacientes com câncer, porque as quebras de fita dupla de DNA e a formação de translocação são as principais consequências deste tratamento. Para iniciar o procedimento de determinação das frequências de translocação estimuladas, inocular 10 a 20 culturas independentes de um mililitro de meio de lactato de glicerol de pico Y com colônias únicas do genótipo desejado, incubar as culturas durante a noite a 30 graus Celsius em um rotador. Quando as culturas atingirem a densidade celular desejada, adicione 20% de galactose às culturas até uma concentração final de 2% A galactose induzirá a expressão da endonuclease ho, que direcionará quebras de fita dupla no alelo delta cinco prim histórico no cromossomo três e tem três alelos delta três prim no cromossomo 15 incubar por quatro horas a 30 graus Celsius em um rotador.

O próximo passo é fundamental para o sucesso do procedimento. A diluição e o plaqueamento cuidadosos das culturas são imperativos. Se você obtivesse frequências de translocação suficientemente reprodutíveis para permitir comparações estatisticamente significativas entre cepas de diferentes genótipos: Após quatro horas, a diluição apropriada das culturas em meio sem histidina e em YPD td aproximadamente 100 a 200 colônias por placa, incube as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias.

Quando surgem colônias, a frequência de translocação pode ser determinada. As eficiências de plaqueamento antes e depois da indução da expressão da endonuclease ho indicarão se a presença ou ausência de qualquer cromossomo de translocação afeta a capacidade de sobreviver à formação de DSB. Isso fragmenta uma cópia do cromossomo três e do cromossomo 15 para determinar as eficiências de pré-indução do plaqueamento.

Primeiro, remova uma alíquota de células de cada cultura noturna e determine o número de células contando com um hemocitômetro. Em seguida, use uma diluição apropriada para colocar aproximadamente 100 a 200 células na incubação YPD por dois a três dias a 30 graus Celsius até que surjam colônias. Adicione 20% de galactose às culturas restantes até uma concentração final de 2% e incube a 30 graus Celsius por quatro horas para determinar a eficiência do revestimento pós-indução.

Remover uma alíquota de células de cada cultura após quatro horas de indução e determinar o número de células por hemocitómetro Contar cerca de 100 a 200 células utilizando uma diluição adequada em YPD, incubar durante dois a três dias a 30 graus Celsius até ao surgimento de colónias. Uma vez que as colônias surgem nas placas, a eficiência do revestimento pode ser determinada. Clones de portadores de translocação putativa podem ser examinados por southern blot.

Este procedimento usa DNA genômico preparado a partir de um único chiado mais colônia recombinante de cada digestão de teste independente, aproximadamente quatro microgramas de cada amostra de DNA com BAM H, uma endonuclease de restrição, BAM H separado, um fragmentos digeridos em um 0,7% aros ela e, em seguida, transferir para uma membrana de nylon carregada positivamente, hibridizada com uma sonda marcada com P 32 obtida por priming aleatório com um BMH de 1,8 KILOBASE, um BMH, um clone genômico contendo o HIS três genes. Visualize fragmentos de DNA por auto-radiografia ou imagem fosfográfica. Outra maneira de examinar clones de portadores de translocação putativa é por análise de gráfico cromossômico.

Os cromossomos são preparados primeiro a partir de chiado selecionado mais recombinantes em plugues aros separam cromossomos em um gel 1% aros em um campo elétrico homogêneo grampeado de contorno ou chef a 14 graus Celsius. Os seguintes parâmetros são usados primeiro bloco 14 graus Celsius, 72º tempo de comutação e 15 horas a seis volts centímetro, segundo bloco, 14 graus Celsius, 122º tempo de comutação e 11 horas a seis volts por centímetro. Na conclusão da eletroforese, visualize os cromossomos colorindo o gel com brometo de AUM por 30 minutos, seguido de irradiação com UV e detendo e destilando os cromossomos de transferência de água para uma membrana carregada positivamente por ação capilar.

As condições de desnaturação hibridizam com sonda marcada com P 32 obtida por priming aleatório com um clone genômico de 1,8 kilobase bam H um bam H contendo o chiado. Três genes visualizam cromossomos por auto-radiografia ou imagem fosfográfica. A frequência de translocações cromossômicas pode ser calculada dividindo o número de colônias fototróficas de histamina pelo número total de células viáveis determinadas por plaqueamento em YPD.

Neste exemplo, a frequência de recombinação calculada é de cerca de 3% O ensaio para frequências de translocação estimuladas por ho pode ser conduzido usando cepas de diferentes genótipos para comparar as diferenças na capacidade de reparar quebras de fita dupla por fita simples. Um ajoelhar-se conforme mostrado neste gráfico representativo. As frequências de translocação obtidas seletivamente e não seletivamente com o homozigoto delta nulo RAD 51 foram estatisticamente diferentes daquelas obtidas usando as condições correspondentes com a cepa do tipo selvagem, tanto pré quanto pós-indução.

As eficiências são determinadas dividindo o número total de células formadoras de colônias viáveis pelo número total de corpos celulares na cultura determinado pela contagem de hemocitômetros, conforme mostrado nesta tabela pré e pós-placa de indução. As eficiências não foram significativamente diferentes para as células do tipo selvagem, o que sugere que a presença ou ausência de qualquer cromossomo de translocação não afeta a capacidade de sobrevivência. Formação de DSB.

A translocação putativa com clones pode ser examinada por análise genômica de southern blot. Uma representação gráfica dos cromossomos relevantes antes e depois da formação da translocação é mostrada aqui. Tamanhos de fragmentos de restrição contendo sequências relevantes geradas por BAM H uma digestão de DNA genômico de cepas parentais e recombinantes e reveladas em blots por hibridização com uma BAM H de 1,8 kilobase.

Seus três clones genômicos estão listados em pares de quilobases para análise de southern blot. O DNA genômico é digerido com uma endonuclease BMH e hibridizado a uma P 32 marcada com 1,8 quilobase. HIS três sondagem para visualizar esses fragmentos de diagnóstico.

0,8 kilobase HIS três delta 201,7 kilobase chiado três delta três primos quatro quilobase T 3 15 5 quilobase T 15 três e oito kilobase sibilam três delta cinco fragmentos primos. A pista A é a diplóide pai. A pista B é um chiado mais translocação não recíproca recombinante e a pista C é uma translocação recíproca dele mais.

A análise cromossômica recombinante de BLO também pode ser empregada para examinar clones portadores de translocação. Os cromossomos intactos preparados em tampões aros são separados por eletroforese de chef e o gel corado com brometo de irídio e visualizado sob luz ultravioleta. Os cromossomos separados são então borrados em náilon e hibridizados com o P 32 marcado com 1,8 kilobase.

Suas três sondagens para visualizar o cromossomo intacto de 1,1 megabase, 15,8 megabase, T 15, três cromossomos de translocação, 0,6 megabase T, três cromossomos de translocação 15 e 0,3 megabase, cromossomo intacto três. A pista A é o pai implantado. A pista B é A sua translocação não recíproca recombinante, e a pista C é uma translocação recíproca mais recombinante.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a frequência de formação de translocação após várias quebras de fita dupla estimuladas por ho.