Imagem de microscopia confocal de árvores dendríticas intactas e morfologia da coluna vertebral em um cérebro de camundongo limpo

Pegue um cérebro de camundongo limpo com células que expressam proteínas fluorescentes e lipídios removidos para transparência para imagens de estrutura profunda com alta resolução.

Uma malha de hidrogel preserva biomoléculas e mantém redes neuronais.

Transfira o cérebro para uma câmara de imagem contendo um anel de agarose para suporte.

Prenda o tecido com adesivo e preencha a câmara com uma solução de correspondência de índice de refração para minimizar a dispersão de luz e criar um ambiente de imagem estável.

Coloque a câmara em um estágio de microscópio confocal e abaixe suavemente a objetiva na solução para estabelecer uma coluna contínua de contato.

Use epifluorescência para localizar regiões de interesse. Em seguida, ajuste os parâmetros de laser e imagem para otimizar a qualidade da imagem.

Capture uma série de pilhas z para criar uma representação tridimensional do tecido.

Use o software apropriado para analisar a morfologia celular, incluindo árvores dendríticas, suas espinhas e a distribuição e densidade dos neurônios.

Para construir uma grande câmara de imagem de tecido para tecidos com mais de 5 milímetros de espessura, use um prato de vidro de 10 centímetros com uma parede alta. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no centro, certificando-se de que o diâmetro do tubo seja grande o suficiente para aceitar o cano da lente objetiva usada. Faça 3% de agarose em água e despeje no espaço entre o prato de vidro e o tubo cônico.

Em seguida, deixe esfriar por uma hora. Isso formará um anel de agarose sólida. Cole firmemente o tecido no fundo da câmara usando supercola e encha a câmara com solução correspondente ao índice de refração, que pode começar a polimerizar, a menos que seja preservada do ar e armazenada a 4 graus Celsius. Adquira a imagem usando um microscópio confocal.

Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes. Coloque a amostra no palco. Aproxime-se cuidadosamente do meio de imersão com a objetiva e forme uma coluna contínua de meios. Usando epifluorescência, encontre um campo de imagem apropriado. Comece definindo as configurações de resolução e velocidade de digitalização.

Se a imagem estiver usando um microscópio confocal, feche totalmente o orifício para obter a menor seção óptica e, portanto, a melhor resolução Z. Aumente gradualmente a potência do laser ou o ganho do sensor até obter uma imagem adequada com uma alta relação sinal-ruído. Se estiver utilizando a imagem em duas cores EGFP ou tdTomato padrão, defina as configurações de coleta de luz.

Defina os parâmetros da pilha Z com base no início e nos pontos finais observados do tecido. Defina o tamanho do passo com base na resolução Z desejada. Tamanhos de passo menores produzirão uma resolução Z maior, mas podem levar ao branqueamento da amostra.

Quando estiver satisfeito com as configurações de aquisição de imagem, adquira a imagem. Certifique-se de que a imagem tenha uma alta relação sinal-ruído e mostre limites distintos de estruturas.