Incorporando o cérebro de Drosophila em uma matriz para imagens de lapso de tempo dos neurônios do relógio circadiano

Comece com uma tampa de placa de Petri contendo o cérebro larval de Drosophila, pré-exposto a um ciclo claro / escuro. A fatia contém neurônios fluorescentes que expressam proteínas.

Adicione um meio rico em nutrientes com antibióticos para apoiar a sobrevivência neuronal e uma solução de fibrinogênio quente.

Misture suavemente a solução para distribuir o fibrinogênio uniformemente.

Coloque uma pequena quantidade dessa mistura na lamínula de um prato com fundo de vidro.

Adicione trombina para reagir com o fibrinogênio para induzir a formação de uma matriz de fibrina tridimensional.

Transfira o cérebro para esta matriz, posicionando-a com o lado anterior para baixo para alinhar os neurônios do relógio para a imagem.

Dobre a matriz sobre o cérebro para ancorá-lo e prevenir o movimento.

Adicione meio rico em nutrientes para inativar a atividade da trombina.

Sele o prato com uma membrana permeável ao gás para manter a hidratação e a viabilidade neuronal.

Realize imagens de fluorescência de lapso de tempo em intervalos específicos.

As mudanças de fluorescência nos neurônios do relógio revelam sua ativação e inibição rítmica, sincronizadas com o ciclo claro/escuro, refletindo os ritmos circadianos, o ciclo de atividade diária.

Depois de transferir o cérebro para a solução de trabalho, dispense o cérebro e o meio na tampa de uma placa de Petri estéril. Em seguida, adicione mais 3,5 microlitros de SAM com antibióticos e adicione 3,5 microlitros de SAM quente com fibrinogênio.

É importante manter o meio SAM com fibrinogênio a 37 graus durante todo esse procedimento.

Em seguida, misture a solução ao redor do cérebro pipetando suavemente com a mesma ponta de pipeta e aspire 2 microlitros da solução para depositar em uma lamínula para um prato com fundo de vidro. Em seguida, adicione 0,8 microlitros de trombina à gota e misture muito rapidamente para inicializar a polimerização, que ficará branca. Em seguida, use uma pinça para pegar suavemente o cérebro e colocá-lo na matriz de fibrina polimerizante.

Adicionando a trombina após o cérebro ser transferido para a gotícula. Não é recomendado, pois complica muito o procedimento.

Oriente o cérebro conforme necessário e empurre-o o mais próximo possível da lamínula. Em seguida, pegue uma camada de fibrina polimerizada e dobre-a no topo do cérebro, usando movimentos pequenos e suaves que não desprendam a matriz. Continue a dobrar camadas de fibrina polimerizada sobre o cérebro de diferentes partes do coágulo para estabilizar o cérebro. Em seguida, deposite 20 microlitros de SAM com antibióticos sobre o cérebro incorporado para interromper a atividade da trombina. Em seguida, coloque um pedaço de membrana de PTFE sobre o meio e cole as bordas da membrana nas partes untadas do prato.