Usando reflectometria espectral para determinar diâmetros de axônio mielinizados em uma fatia de cérebro de camundongo fixa

Pegue um microscópio confocal hiperespectral com uma fonte de laser estabilizada configurada para uma ampla faixa espectral para decodificar a nanoestrutura da bainha de mielina do tecido cerebral.

Use um espelho de referência para capturar o espectro de refletância da linha de base. Remova o espelho e adquira um espectro de deslocamento escuro para correção de ruído do detector.

Transfira uma câmara com uma seção fixa de tecido cerebral para o estágio de microscópio.

Alinhe o plano focal à região do tecido de interesse, garantindo profundidade suficiente para minimizar a interferência da interface vidro-tecido.

A luz do laser é direcionada para a bainha de mielina multicamadas dos axônios.

À medida que a luz interage com a mielina, ocorrem reflexos parciais nas interfaces das camadas, produzindo padrões de interferência devido à variação das espessuras das camadas e dos índices de refração.

Adquira imagens espectrais desses padrões de interferência.

Após a correção da linha de base e análise do sinal, o espectro de refletância revela a periodicidade do número de onda, permitindo a determinação dos diâmetros dos axônios mielinizados.

Monte um espelho de referência na platina do microscópio, com a superfície voltada para a lente objetiva. Se não for fácil colocar o espelho na platina do microscópio, cole um espelho na placa plana. Ajuste a platina do microscópio para alinhar o plano focal com a superfície do espelho. Em seguida, ajuste o ganho do PMT e a potência do laser, considerando a faixa dinâmica do detector.

Sob uma pseudocor, verifique se não há saturação em toda a faixa de comprimento de onda. Se for observada saturação, diminua a potência do laser. Em seguida, execute a aquisição de verificação lambda. Remova o espelho do palco e repita a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura. Em seguida, salve os dados em um formato TIFF multi-empilhado.

Para realizar a aquisição de imagens SpeRe, coloque o tecido montado na platina do microscópio. Para alinhar aproximadamente o tecido ao plano focal da lente objetiva, através de uma ocular, use o modo de fluorescência de campo amplo. Com a varredura ao vivo ativada, controle a platina do microscópio para alinhar o plano focal à região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione uma região-alvo de pelo menos 15 micrômetros de profundidade da interface do tecido de vidro.

Adquira a pilha de imagens espectrais para a região de destino usando o mesmo procedimento demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, salve os dados do tecido e do deslocamento escuro no formato TIFF multi-empilhado. Para processar as imagens no ImageJ, abra os dados espectrais do espelho de referência e do tecido cerebral.

Selecione os ROIs para as pilhas de imagens abertas, a área central para o espelho de referência e o segmento de uma fibra axônica para o tecido cerebral. Em seguida, execute a imagem, empilhe e plote o perfil do eixo z para adquirir os espectros brutos para os ROIs selecionados.

As fibras axonais podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seus comprimentos, portanto, recomenda-se selecionar a ROI em um pequeno segmento de axônio, normalmente inferior a 5 micrômetros, para minimizar artefatos de volume parcial.

Abra os dados de deslocamento escuro, um tomado para o espelho de referência e o outro para o tecido cerebral, e trace o perfil do eixo z como acabamos de demonstrar. Em seguida, use as opções de copiar e colar para salvar todas as opções adquiridas.