Usando reflectometria espectral para determinar diâmetros de axônio mielinizados em uma fatia de cérebro de camundongo fixa
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 4:16 min • May 29th, 2025
Pegue um microscópio confocal hiperespectral com uma fonte de laser estabilizada configurada para uma ampla faixa espectral para decodificar a nanoestrutura da bainha de mielina do tecido cerebral.
Use um espelho de referência para capturar o espectro de refletância da linha de base. Remova o espelho e adquira um espectro de deslocamento escuro para correção de ruído do detector.
Transfira uma câmara com uma seção fixa de tecido cerebral para o estágio de microscópio.
Alinhe o plano focal à região do tecido de interesse, garantindo profundidade suficiente para minimizar a interferência da interface vidro-tecido.
A luz do laser é direcionada para a bainha de mielina multicamadas dos axônios.
À medida que a luz interage com a mielina, ocorrem reflexos parciais nas interfaces das camadas, produzindo padrões de interferência devido à variação das espessuras das camadas e dos índices de refração.
Adquira imagens espectrais desses padrões de interferência.
Após a correção da linha de base e análise do sinal, o espectro de refletância revela a periodicidade do número de onda, permitindo a determinação dos diâmetros dos axônios mielinizados.
Monte um espelho de referência na platina do microscópio, com a superfície voltada para a lente objetiva. Se não for fácil colocar o espelho na platina do microscópio, cole um espelho na placa plana. Ajuste a platina do microscópio para alinhar o plano focal com a superfície do espelho. Em seguida, ajuste o ganho do PMT e a potência do laser, considerando a faixa dinâmica do detector.
Sob uma pseudocor, verifique se não há saturação em toda a faixa de comprimento de onda. Se for observada saturação, diminua a potência do laser. Em seguida, execute a aquisição de verificação lambda. Remova o espelho do palco e repita a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura. Em seguida, salve os dados em um formato TIFF multi-empilhado.
Para realizar a aquisição de imagens SpeRe, coloque o tecido montado na platina do microscópio. Para alinhar aproximadamente o tecido ao plano focal da lente objetiva, através de uma ocular, use o modo de fluorescência de campo amplo. Com a varredura ao vivo ativada, controle a platina do microscópio para alinhar o plano focal à região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione uma região-alvo de pelo menos 15 micrômetros de profundidade da interface do tecido de vidro.
Adquira a pilha de imagens espectrais para a região de destino usando o mesmo procedimento demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, salve os dados do tecido e do deslocamento escuro no formato TIFF multi-empilhado. Para processar as imagens no ImageJ, abra os dados espectrais do espelho de referência e do tecido cerebral.
Selecione os ROIs para as pilhas de imagens abertas, a área central para o espelho de referência e o segmento de uma fibra axônica para o tecido cerebral. Em seguida, execute a imagem, empilhe e plote o perfil do eixo z para adquirir os espectros brutos para os ROIs selecionados.
As fibras axonais podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seus comprimentos, portanto, recomenda-se selecionar a ROI em um pequeno segmento de axônio, normalmente inferior a 5 micrômetros, para minimizar artefatos de volume parcial.
Abra os dados de deslocamento escuro, um tomado para o espelho de referência e o outro para o tecido cerebral, e trace o perfil do eixo z como acabamos de demonstrar. Em seguida, use as opções de copiar e colar para salvar todas as opções adquiridas.
Visão Geral
Este artigo demonstra o uso da microscopia espectrofotométrica de reflexão (SpeRe) com um microscópio confocal hiperspectral para analisar a nanoestrutura de axônios mielinizados em cortes de tecido cerebral fixado. Ao capturar e analisar os padrões de interferência gerados pela bainha de mielina multilamelar, os pesquisadores podem determinar os diâmetros dos axônios com alta precisão.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microscopia
- Imagem óptica
Contexto
- Os axónios mielinizados são fundamentais para a transmissão rápida de sinais no sistema nervoso.
- Métodos tradicionais para medir o diâmetro do axónio podem ser invasivos ou apresentar baixa resolução em escala nanométrica.
- Padrões de interferência óptica provenientes de bainhas de mielina multicamadas oferecem uma forma não destrutiva de avaliar a estrutura axonal.
- A microscopia confocal hiperspectral permite uma análise espectral detalhada de tecidos biológicos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um protocolo para utilizar a refletometria espectral na análise de axônios mielinizados in situ.
- Fornecer um método para determinar com precisão os diâmetros dos axônios em fatias de tecido cerebral fixado.
- Apresentar a aplicação da microscopia confocal hiperspectral na pesquisa neurobiológica.
Métodos Utilizados
- Preparação de cortes de tecido cerebral fixado para imagem.
- Uso de um microscópio confocal hiperspectral com fonte a laser estabilizada que abrange uma ampla faixa espectral.
- Aquisição de espectros de refletância de base usando um espelho de referência e espectros de deslocamento escuro para correção de ruído.
- Alinhamento do plano focal à região de interesse do tecido, garantindo profundidade suficiente a partir da interface vidro-tecido.
- Coleta de pilhas de imagens espectrais dos axônios mielinizados e regiões de referência.
- Processamento de imagens e análise espectral utilizando o ImageJ para extrair espectros de refletância e determinar os diâmetros dos axônios.
Resultados Principais
- Padrões de interferência gerados pela bainha de mielina foram capturados com sucesso usando espectroscopia de reflexão espectral.
- Correções de linha de base e de deslocamento escuro permitiram medições espectrais precisas.
- A análise do espectro de reflectância revelou periodicidade no número de onda correspondente ao diâmetro do axônio.
- A seleção de pequenas regiões de interesse minimizou artefatos devido à heterogeneidade axonal.
Conclusões
- A microscopia refletométrica espectral fornece um método não destrutivo e de alta resolução para analisar in situ a estrutura de axônios mielinizados.
- O protocolo permite a medição precisa dos diâmetros axonais em tecido cerebral fixado.
- Essa abordagem pode facilitar estudos avançados da microestrutura neural e das patologias relacionadas à mielina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição quantitativa dos diâmetros de axônios mielinizados utilizando reflectometria espectral permite uma análise estrutural de alta resolução, essencial para a descoberta de fármacos com foco em neurobiologia. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas para ativos da carteira do SNC. A integração de métricas axonais precisas nos fluxos de trabalho iniciais de descoberta melhora a continuidade translacional e a tomada de decisões ajustada ao risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação quantitativa da microestrutura neural relevante para modelos de doenças.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao fornecer medidas diretas da arquitetura da bainha de mielina.
- Facilita a validação confiável de alvos em vias relacionadas à mielina e em condições neurodegenerativas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de tecido cerebral validados para triagem de compostos posteriores.
- Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para avaliação do diâmetro do axônio.
- Apoia a padronização de ensaios e o reuso de plataformas em fluxos de trabalho de neurobiologia.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras estruturais com biomarcadores relevantes para doenças em estudos translacionais.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica em programas do SNC.
- Oferece valor preditivo para a integridade da mielina em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A medição de axônios baseada em espectrofotometria de reflexão insere-se na transição entre descoberta inicial e pré-clínica, apoiando tanto a verificação de hipóteses quanto o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Biologia da Descoberta: Fornece dados estruturais quantitativos para a validação de alvos baseada em hipóteses.
- Triagem: Oferece medições padronizadas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Gera leituras espectrais que permitem a comparação direta de características axonais entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais com estratégias de biomarcadores pré-clínicos na pesquisa do sistema nervoso central.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de imagem e análise reutilizável para portfólios de neurobiologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Padroniza a medição de axônios em alta resolução para fluxos de trabalho escaláveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência no uso de capital em programas de neurobiologia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos do sistema nervoso central com base em desfechos estruturais quantitativos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal hiperspectral e análise espectral.
- Necessita de acesso a fontes a laser estabilizadas e infraestrutura avançada de imagem.
- Exige padronização entre equipes no que diz respeito à aquisição de imagens e seleção de regiões de interesse (ROI).
- A adaptação entre diferentes tipos de tecidos pode exigir otimização do protocolo quanto à profundidade e correção de fundo.
- Artifatos de volume parcial e heterogeneidade tecidual devem ser controlados por meio de seleção cuidadosa das regiões de interesse (ROI).
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
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Última atualização: 29 agosto 2026