Name: Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a criopreservar embriões de camundongos por vitrificação com etilenoglicol, método de baixa toxicidade que alcança taxas de sobrevivência superiores a 90% após o descongelamento.

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Este estudo foi realizado em cooperação com o Projeto Bioresource Nacional, o Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão.

O esquema geral do experimento é mostrado na figura. 1. 1. Preparação do Reagente <ol><li> Tornar o meio de base (aqui no conhecido como PB1), em uma garrafa de vidro de 100 ml de acordo com o gráfico abaixo: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td glucose></td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (aprox) </td></tr></tbody></table></li><li> Fazer o Ficoll-solução de sacarose (FS): <ol><li> Adicionar os seguintes produtos químicos a 14 ml de solução PB1 em um tubo de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Ficoll 70 e sacarose em PB1 solução e agitar bem até dissolver completamente. </li><li> Depois de verificar a completa dissolução acima, adicione BSA na superfície da solução e mantê-la4oC até BSA esteja completamente dissolvido (&gt; 4 horas ou durante a noite). </li></ol></li><li> Fazer a solução de equilíbrio (EFS20) ea solução de vitrificação (EFS40) em um tubo de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) etilenoglicol, 24% (w / v) Ficoll, sacarose e 0,4 mol / L em PB1 com BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) etilenoglicol, 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L de sacarose * em PB1 com BSA * Para embriões da linhagem BALB / c ou ICR, aumentar a concentração de sacarose a 0,9 sacarose mol / L, pois são mais sensíveis a cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solução </td><td> EFS40 solução </td></tr><tr><td> Etilenoglicol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Solução de FS </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Esterilizar a solução por filtração usando um filte 0,45 mMr. Faça alíquotas em 5 tubos de poliestireno ml e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 6 meses. </li><li> Preparação da solução embrião descongelamento contendo sacarose 0,75 M (TS1) <ol><li> Dissolver 7,7 g de sacarose na PB1 (preparada no passo 1.1) e trazer o volume total de 30 ml. Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 90 mg de BSA sobre a superfície da solução e deixá-lo ficar até que esteja completamente dissolvido. </li><li> Esterilizar a solução por filtração. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol> Nota: TS1 também podem ser preparados a partir de M2 ​​disponível comercialmente. <ol start="6"><li> Dissolver 7,7 g de sacarose em M2 e trazer o volume total de 30 ml. </li><li> Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido. </li><li> Esterilizar a solução por filtração. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4oC. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol></li><li> Solução TS2 (descongelamentocontendo sacarose 0,25 M): <ol><li> Diluir 10 ml TS1 com 20 ml de PB1 ou M2, conforme o caso. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol></li></ol> 2. Vitrificação de embriões de 2 células de rato <ol><li> Prepare duas células de embriões de rato por monta natural ou convencional em técnicas de fertilização in vitro. </li><li> Alíquota de 50 mL em um EFS40 cryotube. Seguir, executar o resto do processo de vitrificação na temperatura ambiente. </li><li> Alíquota de 50 mL de EFS20 no fundo de um de 35 mm ou 60 mm placa de Petri de plástico. </li><li> Transferir até 30 embriões para EFS20 usando um capilar de vidro com apenas a quantidade mínima de meio de cultura. Iniciar um temporizador para 2 min. Nota: os embriões Coloque no fundo da gota. Isso faz com que a desidratação eficiente de embriões. Verificar a morfologia dos embriões por um estereomicroscópio. Embriões desidratados mostram uma morfologia encolhido, como mostrado na figura. 2A.Se eles não são desidratadas o suficiente, espere por mais 1 ou 2 min. </li><li> Em torno de 1,5 min, pegar os embriões a partir da queda EFS20 com apenas a quantidade mínima de solução. Transferi-los para EFS40 na cryotube preparada em 2.1 passo. Nota: Para obter melhores resultados, ajustar o tempo de pegar os embriões, para que todos os embriões podem ser transferidos para EFS40 em torno de 2 min. </li><li> Espere por 1 min. </li><li> Coloque o cryotube diretamente em nitrogênio líquido (LN 2). </li></ol> 3. Descongelar embriões vitrificados duas células-Mouse <ol><li> Antes de descongelar, preparar um prato com 10 gotas mL de meio de cultura de embriões de embriões recuperados (veja o passo 3.13). Cubra o prato com azeite e coloque em uma incubadora de CO 2 até o uso. Nota: Apesar de todos os meios de cultura de embriões de rotina podem ser utilizadas neste experimento, recomendamos mídia com maior osmolaridade, como meio de M16. </li><li> TS1 quente a 37 ° C. </li><li> Coloque em uma máscara facial e cryogloves. Abra a LN 2 tank e recuperar um cryotube contendo embriões. </li><li> Abrir rapidamente o topo do tubo e descartar LN 2. Aguarde 30 segundos para evitar o congelamento a partir de TS1 o próximo passo. </li><li> Use uma pipeta 1000ul para adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) dentro do tubo e misture a solução pipettings suave (cerca de dez vezes em 25 segundos) até que a solução está uniformemente dissolvido. </li><li> Transferência de todo o volume do tubo a uma 60 milímetros de plástico placa de Petri (ou vidro de relógio) (Fig. 3A). Nota: Os embriões devem ser manipulados em temperatura ambiente (22-25 ° C) até que eles são colocados em uma incubadora de CO 2 na Etapa 3.14. </li><li> Iniciar um temporizador para 3 min. </li><li> Em torno de 2 min no TS1, agite levemente o prato até o meio contendo embriões é espalhado sobre a superfície do prato (Fig. 3B). Nota: Isto ajudará os embriões descem até o fundo, porque eles estão flutuando perto da superfície quando transferido para TS1. </li><li> Coloque três gotas de 50 mL de TS2 em diae prato (Fig. 3C). </li><li> Depois de 3 min em TS1, verificar a morfologia de embriões por um estereomicroscópio, que devem ser ligeiramente encolhido. Veja a morfologia de embriões em anteriores (Fig. 2B) e posterior (Fig. 2C) no TS1. Nota: Se os embriões ainda estão inchadas, mantê-los em TS1 por mais 1-3 min. </li><li> Pegar os embriões e transferi-los para a primeira gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar um temporizador para 3 min </li><li> Depois de 3 min, transferência de embriões para a segunda gota e depois para a terceira queda (Fig. 3E). </li><li> Transferência dos embriões para o meio de cultura preparado no Passo 3.1. Os embriões são na forma mostrada na figura. 2D. </li><li> Coloque em um prato de CO 2 incubadora. Cerca de 10 min mais tarde, a transferência de embriões para a próxima gota de meio de cultura para lavar sacarose que foi transitado do TS2. </li><li> Continue cultura em uma incubadora de CO2 até a transferência de embrião. Nota: Embry TransferênciaOS para o oviduto de receptoras no dia da descongelação. Cultura in vitro tempo pode diminuir a viabilidade de embriões em algumas linhagens de camundongos. </li></ol> 4. Resultados representativos: In vitro - e in vivo de embriões desenvolvimento após o descongelamento é apresentado nas Tabelas 1 e 2. As vantagens deste protocolo são a alta capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento e sua ampla aplicabilidade para diferentes linhagens de camundongos. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensão </td><td> No. total de tubos </td><td> N º de embriões vitrificados </td><td> Recuperado (No. (%)) </td><td> Morfologicamente normais (N º (%)) </td><td> Desenvolvimento de blastocistos (n º (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / ca </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. In vitro-desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em linhagens de camundongos comuns <table border="1"><tbody><tr><td> Condição de embriões </td><td> N º de beneficiários do sexo feminino </td><td> N º de embriões transferidos </td><td> Locais de implantação (No. (%)) </td><td> Vivem descendentes (No. (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrificados </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. In vivo desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em camundongos C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. O esquema geral do experimento, incluindo equilíbrio, vitrificação e descongelamento de embriões. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A morfologia de embriões em cada etapa do descongelamento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Thawing procedimento de embriões. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente. (A), Adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) em um cryotube e transferência de todo o volume da solução no cryotube em um prato de plástico. Neste momento, os embriões olhar inchado como mostrado na figura. 2B. (B), espalhe a solução sobre a superfície do prato, agitando suavemente. (C), coloque três gotas de 50 mL de TS2 no prato de plástico. (D), Transferência de embriões para a primeira gota de TS2. Depois de 3 min, os embriões olhar shurunken como mostrado na figura. 2C. (E), transferi-los de sériely no TS2 restantes gotas e depois para o meio de cultura.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Desde o primeiro relato de vitrificação embrião de rato por Rall e Fahy, em 1985, duas, várias melhorias técnicas têm sido feitos para aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento. Uma das modificações mais bem sucedida foi conseguida através da utilização de etileno glicol como crioprotetor por causa de sua baixa toxicidade e alta permeabilidade da membrana. Tais vantagens permitem-nos lidar com embriões congelamento à temperatura ambiente 4; métodos de vitrificação outras requerem embrião entregando a temperaturas mais frias e nem sempre são aplicáveis ​​a algumas linhagens de camundongos incluindo BALB / c 6. O etileno glicol vitrificação primeiro baseado foi desenvolvido por Kasai et al. em 1990 5,7. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Portanto, o método de vitrificação aqui descrito pode ser applicable para muitos laboratórios usando ratos como modelos de pesquisa. O mesmo método também pode ser usado para embriões de camundongos na mórula e blastocisto estágios 8 e 9 embriões de ratos. No entanto, temos encontrado recentemente que a qualidade dos criotubos podem afetar as taxas de sobrevivência dos embriões após o congelamento-descongelamento. Assim, é essencial para examinar a superfície interna do criotubos por sua suavidade antes de embriões vitrificação (por exemplo, ver a Tabela de reagentes e equipamentos específicos). Métodos de vitrificação têm muitas vantagens sobre métodos convencionais de congelamento lento, mas que inerentemente têm uma desvantagem em relação a finalidade de transporte. Como embriões vitrificados deve ser mantida a inferiores a -120 ° C para manter a sua viabilidade, carregadores secos são geralmente utilizados para o seu transporte seguro. Carregadores secos são pesados ​​e volumosos, e sua ida e volta é caro, especialmente para o transporte internacional. Estamos agora a desenvolver um método de vitrificação novoque os embriões vitrificados podem ser armazenados em temperatura de gelo seco (cerca de -80 ° C) durante pelo menos sete dias 10. Este método deve ser a vitrificação da próxima geração.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilenoglicol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 médio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> Meio M2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Criotubo </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogénicos&quot; </td></tr></table>

criopreservação de embriões de camundongos por vitrificação etileno glicol-based

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Criopreservação de embriões de camundongos é uma base tecnológica que suporta ciências biomédicas, porque muitas cepas de camundongos foram produzidos por modificações genéticas eo número está aumentando de forma consistente ano após ano. O seu desenvolvimento técnico começou com lentidão métodos de congelação na década de 1970 1, seguido por métodos de vitrificação desenvolvido no final dos anos 1980 2. Geralmente, a última técnica é vantajosa em sua rapidez, simplicidade e alta capacidade de sobrevivência de embriões recuperados. No entanto, o crioprotetores contidas são altamente tóxicos e podem afetar o desenvolvimento embrionário subseqüente. Portanto, a técnica não era aplicável a certas cepas de camundongos, mesmo quando as soluções são refrigerados a 4 ° C para mitigar o efeito tóxico durante a manipulação de embriões. No Bioresource RIKEN Center, mais de 5000 linhagens de camundongos com diferentes backgrounds genéticos e fenótipos são mantidos 3, e, portanto, ter otimizado a te vitrificaçãonão haver descrição prévia com a qual podemos criopreservar embriões de várias espécies diferentes de camundongos, com os benefícios de sobrevivência embrionária após a vitrificação alta e descongelamento (ou liquefação, mais precisamente), à temperatura ambiente 4. Aqui, apresentamos um método de vitrificação para embriões de camundongos que tem sido utilizado com sucesso no nosso centro. A solução de criopreservação contém etileno glicol, em vez de DMSO para minimizar a toxicidade de embriões 5. Ele também contém Ficoll e sacarose para a prevenção de desvitrificação e ajuste osmótico, respectivamente. Embriões podem ser manipulados em temperatura ambiente e transferida em nitrogênio líquido dentro de 5 min. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Descrevemos também o processo de descongelamento de embriões vitrificados em detalhes porque é um ste críticap para a recuperação eficiente de camundongos vivos. Estas metodologias seria útil para pesquisadores e técnicos que necessitam de preservação das linhagens de camundongos para uso posterior em uma maneira segura e rentável.

Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

A criopreservação de embriões de camundongos é uma base tecnológica que apoia as ciências biomédicas, pois muitas linhagens de camundongos foram produzidas por meio de genética...

O objetivo geral deste procedimento é criopreservar embriões de camundongo em nitrogênio líquido e descongela-los para recuperação de camundongos vivos. Isso é realizado primeiramente imergindo embriões de camundongo em meio de equilíbrio, transferindo-os para meio de vitrificação em um tubo criogênico e, em seguida, colocando-os em um tanque de nitrogênio líquido. Posteriormente, os embriões podem ser descongelados em um meio de alta osmolaridade e incubados em meio de cultura até serem transferidos para fêmeas receptoras.No final, os resultados mostram uma sobrevivência de mais de 90% dos embriões após o descongelamento por vitrificação e taxas de natalidade entre 30 e 70% após a transferência embrionária. A principal vantagem dessa técnica é que o crioprotetor permeável glicol é menos tóxico para os embriões do que o crioprotetor convencional. A demonstração do procedimento será feita por um técnico do meu laboratório antes do início deste protocolo.Prepare dois embriões de camundongo em cultura obtidos por acasalamento natural ou por técnicas convencionais de fertilização in vitro para um tubo de criopreservação para armazenamento futuro; adicione 50 microlitros de solução de congelamento de embriões EF S 40. Em seguida, prepare uma placa de Petri plástica de 35 milímetros ou 60 milímetros com 50 microlitros de EFS 20 à temperatura ambiente.Use um capilar de vidro para transferir até 30 embriões para a placa. Tenha cuidado para evitar a transferência do meio de cultura. Além disso, para garantir a desidratação dos embriões, coloque-os na parte inferior da gota.Após cerca de 60 a 90 segundos, utilize um tubo capilar para aspirar embriões desidratados. Com morfologia encolhida. Transfira esses embriões para a solução EFS no tubo criogênico, transferindo o mínimo possível de EFS 20.Após a transferência dos embriões, deixe-os assentar no EFS 40 por um minuto antes de congelá-los em nitrogênio líquido. Antes do descongelamento dos embriões, coloque em uma placa de cultura pelo menos duas gotas de 10 microlitros de meio de cultura de embriões com alta osmolaridade, como o meio M 16. Em seguida, cubra completamente as gotas com óleo de silicone ou mineral e coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono até o uso.Em seguida, aqueça a solução TS um a 37 graus Celsius usando máscara facial e luvas criogênicas. Retire os embriões do tanque de nitrogênio líquido. Abra rapidamente o tubo criogênico e descarte qualquer nitrogênio líquido no tanque ou em um recipiente apropriado.Em seguida, espere 30 segundos. Agora, adicione 850 microlitros da solução morna de TS um ao tubo de criovial. Aspire e expulse suavemente a solução cerca de 10 vezes para que se dissolva uniformemente.Em seguida, transfira todo o volume para uma placa de Petri plástica de 60 milímetros. Ou espere três minutos em uma lâmina de relógio para que os embriões se equilibrem à temperatura ambiente, onde devem permanecer pelo restante do procedimento. Não utilize um dispositivo de aquecimento.Examine rapidamente os embriões na placa sob um microscópio estereoscópico para verificar como eles se apresentam no início desta incubação. Após cerca de dois minutos de incubação, acomode os embriões agitando suavemente a placa até que o meio se espalhe pela superfície da placa. No último minuto da incubação, ejetar três gotas separadas de 50 microlitros da solução TS dois em uma placa.Quando os três minutos terminarem, use um microscópio estereoscópico para confirmar que os embriões encolheram ligeiramente. Se os embriões ainda estiverem inchados, continue a incubação por mais um a três minutos. Agora, pegue os embriões com uma capilar de vidro e transfira-os para a primeira gota de TS dois.Aguarde três minutos e transfira os embriões para a segunda gota. Em seguida, para a terceira gota. Por fim, retire o prato com meio para embriões preparado armazenado no incubador e utilize uma capilar de vidro para transferir os embriões para a primeira gota do meio.Se examinados sob um estereoscópio, os embriões devem recuperar lentamente sua morfologia normal. Agora, retorne a placa ao incubador por cerca de 10 minutos. Em seguida, lave o sacarose que foi carreado do TS dois.Transfira os embriões para a próxima gota de meio de cultura. Continue a cultura dos embriões na incubadora de CO2 até que sejam transferidos para o útero de fêmeas receptoras. Após a vitrificação e recuperação de entre 300 e 480 embriões de três linhagens diferentes de camundongos, a viabilidade foi muito alta.Após o descongelamento, a fração de embriões que apresentavam morfologia normal estava entre 93 e 99%, e pelo menos 84% desses embriões se desenvolveram em blastocistos. Não se esqueça de que trabalhar com vazamento de nitrogênio pode ser extremamente perigoso, e são necessárias precauções para evitar contato direto e minimizar a exposição em curtas distâncias ao vazamento. O nitrogênio deve sempre ser manipulado realizando este procedimento.

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Biologia

Neste vídeo-artigo apresentamos uma demonstração passo-a-passo sobre como coletar e criopreservar oócitos de hamster com altas taxas de sobrevivência pós-descongelamento. O mesmo procedimento também pode ser aplicado com sucesso congelar e descongelar embriões de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento pré-implantação.

Recolha e criopreservação de óvulos e embriões de camundongos Hamster

Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.

Criopreservação de embriões pré-implantatório de bovinos, ovinos e caprinos

Aqui demonstramos a recém-desenvolvida I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Duas células desenvolvimento embrionário palco com descongelado esperma foi melhorado consistentemente em cinco linhagens de camundongos com a utilização deste kit. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas de camundongos geneticamente modificados foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperados com sucesso por fertilização in vitro.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de vitrificação de embriões de coelho colhidos no estágio de desenvolvimento desejado usando etilenoglicol e dimetilsulfóxido como crioprotetores e palha criogênica como sistema de transporte. Os embriões vitrificados têm alta taxa de sobrevivência e podem ser armazenados por um longo período até o uso.

Vitrificação de embriões de coelho usando palha criogênica: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar embriões de coelho para armazenamento a longo prazo

Este vídeo demonstra o procedimento para descongelar embriões de coelho vitrificados e as etapas de medição preventiva para a recuperação ideal do embrião.

Descongelamento de embriões de coelho: um procedimento de aquecimento para recuperar embriões de coelho criopreservados para transferência de embriões

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

MicroSecure Vitrification foi desenvolvido como um sistema de dispositivo de vitrificação fechado asséptico não comercial que está em conformidade com as boas práticas de fabricação e manuseio de tecidos da FDA. Devido à retirada de canudos de embriões com tamponamento hidrofóbico da indústria, o procedimento de vitrificação foi modificado para incluir uma vedação interna antes do tampão de algodão interno padrão.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

As técnicas reprodutivas assistidas (ARTs) estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Este manuscrito descreve um procedimento de transferência de embriões minimamente invasivo com um protocolo de criopreservação eficiente que permite o uso de coelhos como um modelo animal ideal de reprodução humana.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.

Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

Aqui, apresentamos o protocolo Spatula Montevideo para vitrificação de embriões pré-implantacionais de camundongos e ovelhas, consistindo em uma espátula caseira e utilizando soluções caseiras. Os embriões são rapidamente equilibrados em duas soluções crioprotetoras de concentração crescente, carregadas na espátula, imersas em nitrogênio líquido e, finalmente, seladas com um canudo de 0,5 mL.

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

Aprenda a criopreservar embriões de camundongos por vitrificação com etilenoglicol, método de baixa toxicidade que alcança taxas de sobrevivência superiores a 90% após o descongelamento.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

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