Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based
18 de novembro de 2011
Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.
O objetivo geral deste procedimento é criopreservar embriões de camundongos em nitrogênio líquido e descongelá-los para recuperação de camundongos vivos. Isso é feito primeiro imergindo embriões de camundongos em meio de equilíbrio, transferindo-os para o meio de vitrificação em um tubo criogênico e, em seguida, colocando-os em um tanque de nitrogênio líquido. Os embriões posteriores podem ser descongelados em meio osmótico alto e incubados em meio de cultura até serem transferidos para as fêmeas receptoras.
Em última análise, os resultados mostram a sobrevivência de mais de 90% dos embriões após o descongelamento vitrificado e taxas de natalidade entre 30 a 70% após a transferência do embrião. A principal vantagem desta técnica é que o crioprotetor permeável glicol é menos tóxico para os embriões do que o crioprotetor convencional. Demonstrando o procedimento estará um técnico do meu laboratório Antes de iniciar este protocolo.
Prepare dois embriões de camundongos celulares em cultura obtida por acasalamento natural ou técnicas convencionais de fertilização in vitro em um tubo criogênico para eventual armazenamento, adicione 50 microlitros de solução de congelamento de embriões EF S 40. Em seguida, prepare uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros ou 60 milímetros com 50 microlitros de temperatura ambiente. EFS 20.
Use um capilar de vidro para transferir até 30 embriões para o prato. Tenha cuidado para evitar a transferência do meio de cultura. Também para garantir a desidratação dos embriões, coloque-os no fundo da gota.
Após cerca de 60 a 90 segundos, use um tubo capilar para extrair embriões desidratados. Com uma morfologia encolhida. Mova esses embriões para a solução EFS no tubo criogênico, transferindo o mínimo possível de EFS 20.
Uma vez transferidos os embriões, deixe-os depositar no EFS 40 durante um minuto antes de os congelar em azoto líquido. Antes de descongelar os embriões, coloque em uma placa de cultura pelo menos duas gotas de meio de cultura de embriões de alta osmolaridade de 10 microlitros, como o meio M 16. Em seguida, cubra as gotas completamente com silício ou óleo mineral e coloque o prato em uma incubadora de dióxido de carbono até o uso.
Em seguida, aqueça a solução TS one a 37 graus Celsius enquanto usa uma máscara facial e luvas criogênicas. Recupere os embriões do tanque de nitrogênio líquido. Agora abra rapidamente o tubo criogênico e descarte qualquer nitrogênio líquido no tanque ou em qualquer recipiente apropriado.
Em seguida, aguarde 30 segundos. Agora adicione 850 microlitros de TS quente uma solução ao tubo criogênico. Sugue suavemente e desfaça a solução cerca de 10 vezes para que seja dissolvida uniformemente.
Em seguida, transfira todo o volume para uma placa de Petri de plástico de 60 milímetros. Ou observe o vidro, espere três minutos para que os embriões se equilibrem à temperatura ambiente, onde devem permanecer pelo restante do procedimento. Não use um dispositivo de aquecimento.
Examine rapidamente os embriões no prato sob um microscópio estéreo para saber como eles se parecem no início desta incubação. Após cerca de dois minutos de incubação, afunde os embriões agitando suavemente o prato até que o meio se espalhe sobre a superfície do prato. No último minuto da incubação, ejetar três gotas separadas de 50 microlitros de solução TS dois em um prato.
Quando os três minutos terminarem, use um microscópio estéreo para confirmar se os embriões encolheram ligeiramente. Se os embriões ainda estiverem inchados, continue a incubação por mais um a três minutos. Agora, pegue os embriões com um capilar de vidro e transfira-os para a primeira gota de TS dois.
Aguarde três minutos e transfira os embriões para a segunda gota. Seguido pela terceira gota. Finalmente, recupere o prato de meio embrionário preparado armazenado na incubadora e use um capilar de vidro para transferir os embriões para a primeira gota do meio.
Se examinados sob um estereoscópio, os embriões devem recuperar lentamente sua morfologia normal. Agora, retorne o prato à incubadora por cerca de 10 minutos. Em seguida, para lavar a sacarose que foi transportada do TS dois.
Mova os embriões para a próxima gota de meio de cultura. Continue cultivando os embriões na incubadora de CO2 até que sejam transferidos para a UC das fêmeas receptoras. Depois de vitrificar e recuperar entre 300 e 480 embriões de três linhagens diferentes de camundongos, a capacidade de sobrevivência foi muito alta.
Após o descongelamento, a fração de embriões com morfologia normal estava entre 93 e 99% e, desses embriões, pelo menos 84% evoluíram para cistos blásticos. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio de vazamento pode ser extremamente perigoso e precauções para evitar o contato direto e minimizar a exposição de curta distância ao vazamento. O nitrogênio deve sempre ser tomado realizando este procedimento.
Visão Geral
Este artigo descreve um método de vitrificação baseado em etileno glicol para criopreservação de embriões de camundongo. Esta técnica é vantajosa devido à sua simplicidade e baixa toxicidade embrionária, tornando-a adequada para diversas linhagens de camundongo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Reprodutiva
- Embriologia
Antecedentes
- A vitrificação é um método utilizado para preservar amostras biológicas em baixas temperaturas.
- Os crioprotetores convencionais podem ser tóxicos para embriões.
- O etileno glicol é uma alternativa menos tóxica para a preservação de embriões.
- Este método pode ser aplicado a camundongos endogâmicos e modificados geneticamente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples e eficaz para criopreservar embriões de camundongo.
- Avaliar as taxas de sobrevivência e nascimento de embriões após vitrificação e descongelamento.
- Fornecer um protocolo que possa ser amplamente adotado em laboratórios.
Métodos Utilizados
- Os embriões são imersos em meios de equilíbrio e vitrificação.
- Os embriões são armazenados em nitrogênio líquido para criopreservação.
- O descongelamento envolve a transferência dos embriões para um meio de alta osmolaridade.
- Os embriões são cultivados até estarem prontos para transferência para fêmeas receptoras.
Resultados Principais
- Foram observadas taxas de sobrevivência superiores a 90% após o descongelamento.
- As taxas de natalidade variaram de 30% a 70% após a transferência de embriões.
- Os embriões apresentaram recuperação normal da morfologia após o descongelamento.
- Foram registradas altas taxas de desenvolvimento em blastocistos.
Conclusões
- O método baseado em etilenoglicol é eficaz para a criopreservação de embriões de camundongo.
- Essa técnica minimiza a toxicidade embrionária em comparação com os métodos tradicionais.
- É uma opção viável para diversas linhagens de camundongos na pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criopreservação robusta de embriões de camundongos geneticamente diversos sustenta a continuidade da pesquisa translacional e a flexibilidade dos processos na biofármaca. A vitrificação baseada em etileno glicol permite alta sobrevivência embrionária e ampla aplicabilidade entre linhagens, apoiando o gerenciamento escalável de colônias e a preservação de recursos genéticos. Este método reduz os riscos biológicos e as barreiras operacionais para o acesso a modelos pré-clínicos em programas de descoberta e desenvolvimento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o arquivamento seguro e a recuperação rápida de modelos de camundongos geneticamente modificados para estudos baseados em hipóteses.
- Apoia a validação funcional de alvos ao garantir acesso consistente a sistemas in vivo validados.
- Facilita a triagem de portfólios ao manter um suprimento pronto de diversas origens genéticas para desvio mecanicista de riscos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece embriões padronizados com alta viabilidade para triagem fenotípica e desenvolvimento de ensaios posteriores.
- Garante reprodutibilidade e escalabilidade na geração de coortes pré-clínicas a partir de estoques criopreservados.
- Reduz a variabilidade nas entradas biológicas, apoiando fluxos de trabalho confiáveis de avaliação de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Mantém modelos genéticos relevantes para doenças, permitindo comparabilidade longitudinal e entre estudos.
- Permite a continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica, protegendo linhagens críticas.
- Apoia decisões de avanço com ajuste de risco, garantindo a disponibilidade de modelos para estudos confirmatórios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de vitrificação integra-se na interface entre geração de modelos, manejo de colônias e início de estudos pré-clínicos, permitindo uma transição contínua da engenharia genética para a validação in vivo.
- Biologia da Descoberta: Preserva modelos genéticos validados para testes iterativos de hipóteses e análise de vias.
- Triagem: Fornece embriões de alta qualidade para o desenvolvimento de ensaios reprodutíveis e campanhas de triagem.
- Análises: Oferece leituras quantitativas de sobrevivência e desenvolvimento para avaliar o desempenho da criopreservação.
- Pesquisa Translacional: Garante a continuidade do modelo para alinhamento de biomarcadores e estudos translacionais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade padronizada e reutilizável de criopreservação em todos os programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista ao preservar a fidelidade do modelo.
- Valor Operacional: Otimiza o gerenciamento de colônias com criopreservação e recuperação escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao garantir a disponibilidade do modelo.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço rápido de alvos validados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência técnica no manuseio de embriões e em protocolos de criopreservação.
- Exige acesso a armazenamento em nitrogênio líquido e infraestrutura para descongelamento controlado.
- Exige padronização entre equipes para recuperação e uso posterior consistentes.
- Adaptável a uma ampla variedade de linhagens de camundongos, com otimização do protocolo conforme necessário.
- Precauções de segurança são essenciais ao manipular materiais criogênicos.
