Microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de retina de camundongos
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:18 min. • June 17th, 2025
Coloque uma lamínula contendo tecido retiniano de camundongo montado em membrana sob um microscópio de dois fótons.
O tecido expressa um biossensor de cálcio baseado em FRET em fotorreceptores de cone.
Usando uma objetiva de imersão em água, concentre-se no tecido.
Sob iluminação de fundo, os terminais do axônio do cone permanecem despolarizados, permitindo o influxo de cálcio.
A ligação intracelular de cálcio altera a conformação do biossensor, aproximando os fluoróforos doadores e aceptores.
Comece a imagem de dois fótons.
O laser do microscópio concentra a luz infravermelha de baixa energia no tecido.
No ponto focal do laser, dois fótons excitam simultaneamente o biossensor, desencadeando a transferência de energia do doador para o aceitador.
Isso aumenta a fluorescência do aceptor enquanto diminui a fluorescência do doador.
Calcule a taxa de fluorescência.
Em seguida, forneça estimulação de luz para hiperpolarizar os cones, reduzindo os níveis de cálcio intracelular.
Isso reverte a conformação do biossensor, inibindo a transferência de energia do doador para o aceitador e diminuindo a taxa de fluorescência.
Registre as respostas para analisar a dinâmica do cálcio evocado pela luz nos termi
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