Microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de retina de camundongos

Coloque uma lamínula contendo tecido retiniano de camundongo montado em membrana sob um microscópio de dois fótons.

O tecido expressa um biossensor de cálcio baseado em FRET em fotorreceptores de cone.

Usando uma objetiva de imersão em água, concentre-se no tecido.

Sob iluminação de fundo, os terminais do axônio do cone permanecem despolarizados, permitindo o influxo de cálcio.

A ligação intracelular de cálcio altera a conformação do biossensor, aproximando os fluoróforos doadores e aceptores.

Comece a imagem de dois fótons.

O laser do microscópio concentra a luz infravermelha de baixa energia no tecido.

No ponto focal do laser, dois fótons excitam simultaneamente o biossensor, desencadeando a transferência de energia do doador para o aceitador.

Isso aumenta a fluorescência do aceptor enquanto diminui a fluorescência do doador.

Calcule a taxa de fluorescência.

Em seguida, forneça estimulação de luz para hiperpolarizar os cones, reduzindo os níveis de cálcio intracelular.

Isso reverte a conformação do biossensor, inibindo a transferência de energia do doador para o aceitador e diminuindo a taxa de fluorescência.

Registre as respostas para analisar a dinâmica do cálcio evocado pela luz nos terminais do axônio do cone.

Transfira uma fatia da câmara de retenção para a câmara de registro e comece imediatamente a perfundi-la com uma solução extracelular carboxigenada. Mantenha uma taxa de fluxo de perfusão de 2 mililitros por minuto e uma temperatura de 37 graus Celsius na câmara de registro. Use uma objetiva de imersão em água de 20x, 0.95 NA e uma câmera CCD em combinação com um LED infravermelho abaixo da câmara de gravação para localizar a fatia da retina.

Inicie o sistema de imagem de dois fótons, conforme indicado pelo fabricante. Em seguida, ligue o laser e ajuste-o para 860 nanômetros. Ligue os dois canais de detecção para imagens de fluorescência de ECFP e citrino. Em seguida, usando o software de aquisição de imagem, controle o microscópio de dois fótons para escanear e selecionar uma linha de terminais de cone para gravação. Defina a aquisição de imagem como imagens de 128 por 16 pixels ou uma configuração semelhante.

Restrinja a área escaneada aos terminais do cone para evitar o branqueamento de fotopigmentos nos segmentos externos. Ligue o laser. Deixe os cones se adaptarem ao laser de varredura e à luz de fundo do estímulo por 20 a 30 segundos antes de apresentar estímulos luminosos ou aplicar agentes farmacológicos. Agora, comece a apresentação dos estímulos arbitrários. Os estímulos são gerados modulando a intensidade dos dois LEDs ao longo do tempo, usando uma placa microprocessada controlada por software personalizado. Em seguida, comece a gravar os dois canais de fluorescência simultaneamente usando o respectivo software de aquisição de imagem.