Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos
13 de setembro de 2011
Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).
O objetivo geral deste procedimento é estudar as propriedades eletrofisiológicas cardíacas, como condução, repolarização, arritmogênese e manuseio de cálcio, utilizando técnicas de mapeamento óptico no coração de coelho perfundido com langor. Isso é realizado primeiramente isolando e perfundindo retrogradamente um coração de coelho intacto por meio da aorta. O próximo passo do procedimento consiste em expor a superfície do coração, abolir as contrações cardíacas utilizando inibição da excitação-contração com blebbistatina e corar adequadamente o miocárdio com indicadores fluorescentes sensíveis à voltagem e ao cálcio.
Em seguida, são realizadas gravações de potenciais de ação ópticos de grande parte do epicárdio ventricular utilizando o sistema de mapeamento óptico panorâmico. Os sinais ópticos são então mapeados em uma geometria 3D reconstruída da superfície epicárdica do coração. Durante este passo, o potencial de ação óptico e a transiente de cálcio podem ser registrados simultaneamente usando o sistema de imagem dupla não panorâmico.
Este procedimento fornece dados quantitativos do miocárdio espacial e temporal, excitação e repolarização, bem como características congruentes do manejo de cálcio, que podem ser analisadas durante ritmo regular, bem como arritmias atriais e ventriculares. Olá, meu nome é Dra. Iger Eov. Sou professora de engenharia biomédica na Universidade de Washington em St. Louis.
A técnica óptica que apresentamos hoje é uma tecnologia única que possui diversas vantagens sobre micro e microeletrogramas tradicionais, pois é capaz de registrar simultaneamente dezenas, dezenas de milhares de potenciais de ação e transientes de cálcio. Além disso, esta tecnologia é imune a artefatos provocados por estimulação elétrica e desfibrilação, os quais distorcem fortemente os potenciais de ação registrados por qualquer eletrograma. Ademais, os transientes de cálcio só podem ser registrados por meio desta técnica.
Não há simplesmente alternativa. Este método pode ajudar a responder as questões-chave na área da eletrofisiologia cardíaca, como os mecanismos de indução, manutenção e término de arritmias atriais e ventriculares potencialmente fatais, bem como a modelagem funcional na condução e excitação e acoplamento excitação-contração em doenças como cardiopatia congênita, doença metabólica e insuficiência cardíaca. Após o preparo para a cirurgia, eutanasiar um coelho com um coquetel de pentobarbital sódico e heparina.
Assim que a lebre deixar de responder a um reflexo de dor, abra o tórax e remova o coração e os pulmões. Faça um corte na extremidade superior da aorta ascendente antes de todos os ramos do arco aórtico, ligue a bomba para iniciar o fluxo da solução de Tyro no sistema de perfusão LRF não recirculante. Monte rapidamente o coração na cânula de aorta 16 conectada ao sistema de perfusão LOR.
Elimine o ar da aorta e amarre a cânula da aorta assim que a perfusão estiver completa. Não perca tempo em abrir o pericárdio. Em seguida, remova o tecido adiposo da traqueia pulmonar ao redor do coração e os tecidos conjuntivos.
É muito importante evitar o acúmulo de fluido no ventrículo esquerdo, o que causaria isquemia. Portanto, insira um tubo drenante de silicone através de uma veia pulmonar e da válvula mitral e até o ventrículo esquerdo. Agora, mova o coração com a cânula para o sistema de perfusão Langendorff recirculante equipado com sistema de mapeamento óptico.
Coloque o coração em uma câmara hexagonal personalizada e conecte a cânula ao sistema de perfusão. Monitore a pressão aórtica utilizando um transdutor de pressão e mantenha-a em torno de 60 ± 5 milímetros de mercúrio ajustando a taxa de fluxo da bomba de perfusão. Mantenha o pH em torno de 7,35 ± 0,05.
Desligue a luz do ambiente e injete lentamente a solução estoque de estatina BLEs sensível à luz através do portão de injeção no aprisionador de bolhas de ar localizado acima da cânula. Para atingir uma concentração de 10 micromolar de estatina BLEs, injete lentamente 0,1 mililitros de estatina BLEs. Para cada injeção em bolus, espere a pressão estabilizar antes da próxima injeção.
Posicione os arranjos de fotodiodos ou PDAs em três ângulos igualmente espaçados ao redor do coração. Em seguida, em cada PDA, foque a imagem do coração na superfície fosca do vidro do plano da imagem. Ajuste a posição da cânula na câmara hexagonal e de cada PDA até que o coração caiba no campo de visão dos três PDAs.
Em seguida, tire uma foto de cada imagem focalizada no vidro fosco. Injete lentamente 10 a 20 microlitros da solução estoque de D quatro Anep na solução de perfusão através do porto de injeção no trampa de bolhas de ar. E aguarde três minutos.
Em seguida, coloque suavemente o eletrodo de marcação na localização desejada. Aqui, ele é posicionado no centro da vista anterior do coração. Inicie a gravação óptica simultânea dos PDAs.
Certifique-se de que não há artefatos de movimento no sinal óptico e de que a relação sinal-ruído é suficiente para a análise subsequente dos dados. Quando terminar, acenda as luzes do ambiente e faça um registro fotográfico do coração tirando uma fotografia a cada 10 graus de rotação, utilizando uma câmera posicionada no local de um dos PDAs. Em seguida, prossiga com a limpeza do sistema de perfusão.
Coloque o coração canulado em uma câmara de vidro rad naughty e conecte a cânula ao sistema de perfusão. Fixe o coração na base de silicone da câmara no ápice ventricular e nas átrias. Para imobilizar o coração, desligue a luz do ambiente e injete lentamente BLEs statin através do porto de injeção para reduzir o movimento da superfície da solução.
Coloque uma tampa de vidro sobre a superfície epicárdica. Esta parte do procedimento normalmente é feita no escuro, mas está sendo realizada sob luz. Para melhorar a imagem do vídeo, mova o sistema de imagem dupla para cima do coração.
Agora, foque as duas câmeras CMO no mesmo campo de visão. Em seguida, posicione os guias de luz para duas lâmpadas halógenas com filtro de excitação. Contraste o coração adicionando de 10 a 20 microlitros do corante sensível à voltagem RH 2 37 através do orifício de injeção.
Em seguida, adicione 200 microlitros de road 2:00 AM com onic F1 27 em uma mistura um para um através da porta do trampa de bolhas. Aguarde aproximadamente 20 minutos para permitir a DSificação do road 2:00 AM antes de iniciar o mapeamento. Agora, realize uma gravação de teste.
Desligue a bomba de superfusão para evitar movimento na superfície da solução. Ligue as lâmpadas de halogênio e realize uma gravação óptica com ambas as câmeras. Em seguida, desligue a luz de excitação.
Ligue a bomba de superfusão e verifique a qualidade dos sinais ópticos. Se o sinal estiver fraco, reestime o coração com RH 2 37 adicional e road 2:00 AM. Se houver artefato de movimento, adicione estatina BLE adicional para eliminar o movimento com tudo em ordem. Prossiga com o experimento planejado e limpe o sistema.
Quando concluído, o sistema de mapeamento óptico panorâmico foi utilizado para mostrar esta vista anterior de um coração de coelho Langendorf perfundido. Por comparação, uma reconstrução da geometria do coração mostra a mesma vista anterior. A superfície epicárdica desenrolada mostrada aqui é codificada por cores de acordo com a fase.
O coração estava passando por um episódio de arritmia taquicárdica proveniente de cinco locais ao redor do rotor. Os potenciais de ação ópticos foram apresentados. Aqui, em vermelho, está uma frente de ativação se propagando durante um ciclo de arritmia reentrante estável.
O frente de onda gira no sentido horário ao redor de uma singularidade de fase na superfície anterior do coração. A repolarização é representada em azul transparente para permitir a visualização das frentes de onda na superfície posterior. O coração foi analisado utilizando o sistema de mapeamento duplo para mostrar o mapeamento simultâneo de potenciais de ação e transientes de cálcio.
Uma visão ampliada das gravações de um sítio mostra potenciais de ação em azul e transientes de cálcio em vermelho. Uma matriz de traços de exemplo é mostrada a partir de uma série de sítios igualmente espaçados, conforme representado pelos pontos nesta vista anterior. Esses dados foram coletados com resolução óptica de 200 micrômetros por 200 micrômetros por pixel.
As implicações da terapia ampliam a terapia de desfibrilação para arritmias atriais e ventriculares de 10 K, pois podemos visualizar diretamente o efeito de estímulos elétricos fortes durante a eletroterapia. Nenhum método alternativo é capaz de fazer isso. Com este método, desenvolvemos e validamos uma nova terapia de dessincronização com baixa voltagem e indolor para fibrilação atrial e taquicardia ventricular.
Visão Geral
Este artigo descreve os procedimentos para realizar experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho perfundido pelo método Langendorff utilizando um sistema de imagem panorâmica. O estudo foca-se nas propriedades eletrofisiológicas cardíacas, incluindo condução e manuseio de cálcio.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Eletrofisiologia Cardíaca
- Técnicas de Mapeamento Óptico
- Arritmogênese
Antecedentes
- O mapeamento óptico permite o registro simultâneo de potenciais de ação e transientes de cálcio.
- Este método fornece informações sobre a função cardíaca e as arritmias.
- Os métodos tradicionais podem ser limitados por artefatos provocados pela estimulação elétrica.
- O estudo utiliza um modelo de coração de coelho perfundido por Langendorff.
Objetivo do Estudo
- Investigar a condução cardíaca, a repolarização e a arritmogênese.
- Analisar o manuseio de cálcio no miocárdio.
- Fornecer dados quantitativos sobre a dinâmica da excitação e da repolarização.
Métodos Utilizados
- Isolamento e perfusão retrógrada do coração de coelho.
- Coloração do miocárdio com indicadores fluorescentes sensíveis à voltagem e ao cálcio.
- Gravação de potenciais de ação ópticos utilizando um sistema panorâmico de mapeamento óptico.
- Imagem dual simultânea de potenciais de ação ópticos e transientes de cálcio.
Resultados Principais
- Dados quantitativos sobre as características espaciais e temporais do miocárdio.
- Informações sobre os mecanismos de arritmias e doenças cardíacas.
- Demonstração das vantagens do mapeamento óptico em comparação com eletrogramas tradicionais.
Conclusões
- A mapeamento óptico é uma ferramenta poderosa para o estudo da eletrofisiologia cardíaca.
- Essa técnica pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa de arritmias.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para obter insights mais profundos sobre a função cardíaca.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O mapeamento óptico em corações de coelhos perfundidos pelo método Langendorff permite a visualização de alta resolução e livre de artefatos da eletrofisiologia cardíaca, apoiando a desmistificação mecanicista na validação de alvos antiarrítmicos. Esta abordagem fornece dados quantitativos espaço-temporais sobre potenciais de ação e transientes de cálcio, informando diretamente a confiança preditiva em modelos pré-clínicos de arritmias ventriculares e atriais. O método integra a biologia descritiva e a pesquisa translacional ao permitir a avaliação reprodutível e escalonável do risco proarrítmico e da resposta terapêutica em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento da dinâmica de ondas reentrantes e singularidades de fase durante arritmias induzidas.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da imagem simultânea de voltagem e cálcio, reduzindo os riscos associados aos mecanismos de acoplamento excitação-contração.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar a vulnerabilidade do substrato arritmogênico sob condições controladas de perfusão.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo fenótipos eletrofisiológicos e de manuseio de cálcio como referência.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio do controle da perfusão Langendorff e protocolos de coloração com corantes.
- Escalabilidade: Destaca a aptidão para triagem por meio de sistemas de imagem panorâmica e dupla capazes de registrar simultaneamente em múltiplos sítios ópticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Utiliza modelo de coração de coelho com similaridade comprovada em relação ao acoplamento excitação-contração e padrões de ondas de arritmia em humanos.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica por meio da análise quantitativa da condução, repolarização e captação de cálcio durante ritmo regular e arritmia.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer insights mecanicistas sobre a indução, manutenção e término de arritmias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, permitindo o aprimoramento iterativo de candidatos antiarrítmicos com base em perfis eletrofisiológicos e de manuseio de cálcio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao visualizar as relações entre a dinâmica do rotor e o transiente de cálcio do potencial de ação durante a arritmogênese.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio da aquisição reprodutível de sinais ópticos com razão sinal-ruído suficiente para análise espaço-temporal.
- Análises: Destaca medições quantitativas da dinâmica de excitação e repolarização, permitindo a avaliação comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta o método à continuidade pré-clínica por meio de modelos de arritmia relevantes para doenças e insights sobre o manejo de cálcio relevantes para insuficiência cardíaca e doenças metabólicas.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o sistema de mapeamento óptico como uma plataforma reutilizável para avaliação de múltiplos compostos ou modificações genéticas em uma preparação padronizada de coração perfundido.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista nos mecanismos de arritmia.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade das medidas eletrofisiológicas e dos transientes de cálcio.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar mais precisas, eficiência de capital e redução do risco biológico em estágios avançados em programas cardiovasculares.
- Impacto no Portfólio: Priorização e tomada de decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados quantitativos de risco de arritmia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento cardíaco, perfusão Langendorff e manipulação de corantes fluorescentes.
- Exige sistemas de mapeamento óptico com matrizes de fotodiodos ou câmeras CMOS, fontes de luz e controle de pressão de perfusão.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de coloração, desacoplamento excitação-contração e parâmetros de aquisição de sinal.
- Envolve considerações de adaptação para taxas de fluxo, óptica e carregamento de corante específicos de espécies ao estender além de corações de coelho.
- Inclui limitações práticas, como fotodesvanecimento do corante, suscetibilidade a artefatos de movimento e a necessidade de manutenção precisa de temperatura e pH durante os experimentos.
