Name: Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a concentrar e extrair metabólitos de comunidades fitoplanctônicas de baixa densidade para metabolômica ambiental utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Este método permite analisar perfis metabólicos em amostras naturais e experimentais.

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Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Grants-in-Aid para a Investigação Científica para impugnar pesquisa exploratória (JK), e da Investigação Científica (A) (JK e SM) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão . A Riken FPR comunhão (RCE) forneceu apoio adicional. Os autores expressam sua gratidão para com os drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto para assistência técnica com RMN e análises estatísticas.

1. Preparação filtro para remover Extraíveis <ol><li> Use 25-mm de diâmetro de poro de 0,22 um tamanho de filtros PVDF Durapore hidrofílico (Millipore). Coloque filtros em uma proveta de 500 ml limpa Pyrex usando uma pinça. Pré-lavagem três vezes com água destilada. Redemoinho bem como de enxaguar para impedir que os filtros se colem umas às outras. Adicionar 300 ml Milli-Q (Millipore) ou de água de alta qualidade equivalente. Autoclavar para facilitar a remoção completa de extraíveis a partir dos filtros. </li><li> Decantar a Milli-Q e novamente tripla lavagem dos filtros, desta vez com Milli-Q. O uso de filtros lugar pinças individuais sobre uma superfície limpa e seca (tal como folha de alumínio) e, ou seca a uma temperatura razoável (por exemplo 37 ° C) ou de ar seco. Os filtros agora está pronto para usar. </li></ol> 2. A filtração do material de amostra <ol><li> Para demonstrar este protocolo, a Millipore aço inoxidável 3 º lugar-tubo do filtro com colunas de 25 mm de microanálise de filtros de vidro com suportee uma bomba mecânica é utilizada. Utilizando uma técnica asséptica, colocar um filtro de 25 mm único na base da coluna de filtro, aplicar a coluna e pinça juntos. </li><li> Carregar 15 ml de amostra na coluna, abrir o obturador sobre o tubo do filtro, e ligar a bomba. Filtrar sob pressão suave para minimizar a quebra das células (&lt;kPa 5). Outras bombas, tais como mão ou uma bomba peristáltica podem ser adaptados a este protocolo. Para amostras de densidade mais baixa, adições sucessivas de água pode ser necessário, não deixe o filtro ficar seca por um período prolongado de tempo entre as adições de água. </li><li> Para amostras marinhas, depois de ter filtrado a sua amostra, você pode realizar uma de água doce opcional enxágüe para reduzir os íons paramagnéticos residuais em sua amostra e no filtro. Isso pode ajudar com mais ajuste preciso do magneto do espectrômetro. Simplesmente suavemente adicionar um pequeno volume de água e filtrar através de sua amostra recolhida no final. </li><li> Uma vez que a filtragem está terminado, desligue a bomba e deixar o ope válvulan por isso ainda há a pressão negativa sob o filtro. Remover o grampo e coluna de filtro. </li><li> Com uma mão, use uma pinça limpa para tomar posse do filtro. Dobre o filtro em si, mas não prega. Com a outra mão use o lábio de um tubo de microcentrífuga estéril 2-ml para segurar o filtro. Solte as pinças, em seguida, usá-los para voltar a agarrar ambas as bordas do filtro. Regrip em um ângulo de 45 ° ao redil. </li><li> Colocar o filtro para dentro do tubo 2-ml e libertação de modo que se abre com o lado da amostra virada para dentro. Você pode colocar até dois filtros para o tubo de microcentrífuga estéril 2 ml desta forma. Se usando dois filtros, assegurar que eles se sobrepõem tão pouco quanto possível. Imediatamente congelar (pelo menos -30 ° C). </li></ol> 3. Extracção do aquosa solúveis em metabolitos <ol><li> Liofilizar suas amostras durante a noite ou por pelo menos 10 horas. </li><li> Após liofilização, adicionar um triturador de aço inoxidável a cada tubo (Tokken). Adicionar 750 ul de potássio padronizadatampão fosfato de RMN em óxido de deutério (2 H&gt; 90%) com 2,2-Dimetil-2-silapentane-5-sulfonato de (DSS) padrão (KPI; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM de K 2 HPO 4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% de D 2 O) 2. </li><li> Sonicar as amostras durante 5 minutos a 4 ° C num sonicador água (Bioruptor, Diagenode) para remover o material celular a partir do filtro. Remover os filtros com pinças limpas. </li><li> Dissociação das células utilizando um triturador de moinho (1600 rpm) durante 5 minutos. </li><li> Incubar a 65 ° C com agitação (1400 rpm) num agitador de bancada (Eppendorf) durante 15 minutos. </li><li> Remover o porco de metal com uma pinça limpas, e centrifugar a amostra a 13.000 g durante 5 minutos. </li><li> Colhem-se o sobrenadante directamente para um tubo de RMN para espectroscopia de RMN. </li></ol> 4. Espectroscopia de RMN e Análise de Dados <ol><li> Carregue o seu exemplo em um espectrômetro de RMN (aqui, um Bruker DRX-500 equipado com espectrômetroTXI sonda com triplo-eixo gradiente controlado por um computador que executa Xwin-RMN). </li><li> 1D obter 1 H espectros de RMN utilizando métodos adequados previamente publicados 2,15 a partir da interface Xwin-RMN. No presente estudo 1 H espectros de RMN foram registados num espectrómetro de funcionamento DRX-500 em 500,03 MHz a 298 K. sinais de água residuais foram suprimida pela sequência de pulso Watergate, com um tempo de repetição de 1,2 s. 128 transientes foram coletadas para obter 32.000 pontos de dados por espectro. </li><li> Transfira os diretórios de dados de RMN para um PC instalado NMRPipe software 16. Processar os dados brutos e DSS definir como 0 ppm de referência, em seguida, manualmente fase do espectro. Digitalizar os dados espectrais em um conjunto de valores discretos, integrando ou "binning-los" com softwares como o rNMR, Automics, ou usando o pacote FT2B publicamente disponível no site da ECOMICS ( <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. Em diaé exemplo, os espectros foram integrados entre 0,5 e 10,5 ppm ao longo de 0,032 ppm regiões integral usando ECOMICS e normalizado para tanto DSS ou a intensidade do sinal total. Os dados de saída agora pode ser usado para análise estatística jusante, tais como análise de componentes principais (PCA), utilizando softwares livres como o R 18. </li></ol> 5. Os resultados representativos Um exemplo de um espectros de RMN H obtidos utilizando os métodos acima são mostrados na Figura 1. Estas amostras, a partir de dois pontos de tempo de uma experiência de microcosmos mostram diferenças claras devido a algas actividades metabólicas. O espectro de 4 dias mostra abundância considerável de picos, particularmente na gama de 3-4 ppm em comparação com a amostra de 1 dia. Estes picos pode ser atribuída aos açúcares produzidos por floração diatomáceas dentro do microcosmo. Em um experimento semelhante comparando o crescimento de comunidades naturais de plâncton na água do mar artificial ou natural, abordagens estatísticas such como principal componente trama pontuação análise (PCA) derivado a partir de espectros de RMN binned pode ser usado para mostrar claras diferenças metabólicas entre os dois tratamentos (Fig. 2), enquanto que as parcelas de carregamento pode identificar picos dentro do espectro que forma a distribuição dos dados . Tais resultados podem ser comparados com dados de outros níveis ómicas, tais como a partir de métodos de impressão digital genómicas (Fig. 3). Estes picos de RMN podem ser consultados individualmente (por exemplo, no BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ) 19, ou espectros inteiro pode ser analisados ​​estatisticamente (por exemplo, com SpinAssign em <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. jp / ação? = nmr_search</a> ) 2. Neste exemplo, as diferenças entre tratamentos foram devido a uma abundância de picos na região açúcares (3,39 ppm para 4,04 ppm) dos espectros de metabolitos naturais da comunidade de plâncton, e vários picos característicos para as comunidades água do mar artificial foram tentativamente identified como de lactato e formiato usando SpinAssign. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Representativas 1 H espectros de RMN obtido a partir de amostras processadas usando este procedimento. As amostras foram tomadas antes microcosmos (dia 1) e durante (dia 4) bloom de diatomáceas uma intensa. Experiências de RMN foram realizadas num Bruker DRX-500 com sinais normalizados para a altura do pico do padrão interno (DSS; 0 ppm). <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Análise de Componentes Principais enredo pontuação (PCA) para espectros de RMN de binned metabolomes das comunidades microbianas de origem natural planctônicas cultivadas em microcosmos com naturais (diamantes abertos) ou água do mar artificial (círculos pretos). Limpar diferenças metabólicas pode ser observado no diagrama de dispersão. Um gráfico de carregamento de uma tal análise pode então ser usado para identificar picos distintos de importância nao sistema; estes picos pode ser ainda analisada conforme necessário. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 3"> Figura 3. Um exemplo de multi-omics análise combinando RMN com os dados genéticos. Composição da comunidade com base na electroforese em gel com gradiente desnaturante de 18S (esquerda) e 16S (direita) de genes de rRNA das mesmas amostras como analisados ​​na Figura 2 também mostra os padrões de microbianas distintas da comunidade entre naturais (diamantes abertos) e microcosmos artificiais (círculos pretos) de água do mar. Essa correspondência entre metaboloma e genoma dos sistemas naturais demonstra a utilidade dessa abordagem.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método de extração e filtração metabólito demonstrado aqui permite a biomassa microbiana planctônica a ser coletadas em quantidade suficiente para metabolômica RMN. Enquanto a extracção apenas de solução aquosa solúveis em metabolitos usando KPi e 1D 1 H RMN é demonstrado, outros solventes de extracção e abordagens espectroscópicas pode ser usado. Um exemplo útil é a utilização de metanol deuterado como solvente semi-polar, que tem sido mostrado para produzir espectros de RMN superiores a partir de amostras...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 0,22 hidrofílicos Durapore filtros PVDF, 25 mm </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Titular Microanálise do filtro, 25 mm, de frita de vidro suporte </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3 º lugar-colector, 47 mm, em aço inoxidável </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Wako </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> Óxido de deutério, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge Isotope Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> Trituradores de aço inox incluído </td></tr><tr><td> Thermomixer conforto </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Evaporador de vácuo </td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> NMR </td><td> Bruker </td><td> DRX-500 com 5 mm de sonda TXI </td><td></td></tr><tr><td> Ferramenta binning Spectral </td><td> Originalmente desenvolvido </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> Ferramenta de anotação de metabólitos e banco de dados </td><td> Originalmente desenvolvido </td><td> SpinAssign </td><td>= Nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para metabolomics ambiental utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Metabolômica Ambiental é um campo emergente que está promovendo uma nova compreensão de como os organismos respondem e interagem com o ambiente e entre si, no nível bioquímico 1. Nuclear espectroscopia de ressonância magnética (RNM) é uma de várias tecnologias, incluindo cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), com a promessa considerável para tais estudos. Vantagens de RMN são de que ele é adequado para análises não-alvo, fornece informações estruturais e espectros podem ser consultados de maneira quantitativa e estatística em bancos de dados recentemente disponíveis de espectros metabólito indivíduo 2,3. Além disso, dados espectrais de RMN podem ser combinados com dados de outros níveis genómica (transcritômica por exemplo, genómica) para fornecer uma compreensão mais abrangente das respostas fisiológicas de taxa para o outro e ao meio ambiente 4,5,6. No entanto, de RMN é menos sensível do que outras técnicas de metabolômica, tornando difícil a APply para sistemas microbianos naturais, onde as populações de amostras podem ser concentrações de baixa densidade e metabólito baixo em comparação com metabólitos de bem-definida e facilmente extraíveis fontes, tais como tecidos inteiros, fluidos biológicos ou de células-culturas. Por conseguinte, os poucos estudos directos ambientais metabolômica de micróbios realizadas até à data têm sido limitados a cultura à base de ou facilmente definido de alta densidade, tais como os ecossistemas hospedeiro simbióticas-sistemas, construídos co-culturas ou manipulações do ambiente intestino, onde rotulagem isótopo estável pode ser adicionalmente utilizado para aumentar os sinais de RMN 7,8,9,10,11,12. Métodos que facilitam a concentração e recolha de metabolitos ambientais em concentrações adequadas para RMN faltam. Uma vez que a atenção recente tem sido dada aos metabolômica ambientais de organismos dentro do meio aquático, onde a maior parte do fluxo de energia e material é mediada pela comunidade planctônicas 13,14, desenvolvemos um método para a concentraçãoção e extração de todo-comunidade metabólitos de sistemas microbianos planctônicos por filtração. Hidrofílicos disponíveis comercialmente poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF) os filtros são especialmente tratado para remover completamente os extraíveis, que podem de outro modo aparecem como contaminantes em análises subsequentes. Estes filtros tratados são então usados ​​para filtrar amostras ambientais ou experimental de interesse. Filtros contendo o material da amostra molhada são liofilizadas e aquosa solúveis em metabolitos são extraídos directamente para a espectroscopia de RMN convencional, utilizando um tampão de extracção padronizados de potássio fosfato 2. Os dados derivados desses métodos podem ser analisados ​​estatisticamente para identificar padrões significativos, ou integrados com outros níveis genómica para compreensão abrangente da comunidade e função do ecossistema.

Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

A metabolômica ambiental é um campo emergente que está promovendo novas compreensões sobre como os organismos respondem e interagem com o ambiente e entre si...

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear oferece diversas vantagens distintas para pesquisas de metabolômica ambiental, mas é relativamente insensível neste procedimento. É relatado um método de filtração para a concentração e extração de metabólitos de comunidades inteiras a partir de sistemas platônicos adequados para RMN. Isso é realizado primeiramente preparando-se filtros especialmente para a coleta de amostras mediante a remoção de substâncias extraíveis.O segundo passo do procedimento é filtrar a amostra, natural ou experimental, sobre os filtros. O terceiro passo do procedimento é fixar o material da amostra e extrair os metabólitos. O passo final do procedimento é analisar as amostras utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear e integrar os dados conforme apropriado.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram alterações metabólicas em amostras naturais ao longo de gradientes ambientais ou em resposta a manipulações experimentais, por meio das abordagens de metabolômica e transams. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a centrifugação, é que a comunidade total pode ser amostrada e volumes maiores de amostra

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Biologia

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Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

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Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

A neuroquímica do cérebro de mamíferos é alterada em muitas doenças neurológicas e sistêmicas. Perfis característicos de metabólitos cerebrais podem ser obtidos com eficiência com base em extratos brutos de tecido cerebral. Para isso, é empregada espectroscopia de RMN de alta resolução, permitindo uma análise quantitativa detalhada das concentrações de metabólitos (metabolômica).

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Aqui, de alta resolução de 1 H e 13 C de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi usada como uma ferramenta rápido e fiável para a análise quantitativa e qualitativa dos suplementos de óleo de peixe encapsulado.

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Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Este protocolo descreve uma única taxa de transferência de técnicas complementares, analíticas e omics, culminando em uma caracterização-pareado de matéria orgânica natural e proteomics microbiana nos diferentes ecossistemas. Esta abordagem permite comparações robustas para a identificação de vias metabólicas e transformações importantes para descrever a produção de gás de efeito estufa e prevendo respostas a mudanças ambientais.

Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Este artigo apresenta o uso de PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE no perfil metabólico de plantas e inclui procedimentos detalhados para preparação de amostras e registro ideal de espectros de RMN Pure Shift. Exemplos através dos quais o ganho de resolução alcançado pelo desacoplamento homonuclear permite uma compreensão mais abrangente do sistema são discutidos.

Ressonância magnética nuclear de deslocamento puro: uma nova ferramenta para metabolômica de plantas

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é usada para identificar desregulação nos metabólitos em pacientes com várias doenças. Essa técnica permite a quantificação dos metabólitos perturbados, desvendando os insights fisiopatológicos. Aqui, descrevemos o procedimento passo a passo da abordagem baseada em RMN para a caracterização metabólica dos pacientes.

Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Este protocolo visa preservar metabólitos celulares para espectrometria de massa de célula única (SCMS), combinando lavagem de solução salina volátil, têmpera rápida de nitrogênio líquido, liofilização e armazenamento de -8 °C. Isso demonstra que a extinção do nitrogênio líquido é essencial para manter os perfis de metabólitos, enquanto o armazenamento refrigerado prolongado deve ser minimizado para evitar alterações metabólicas.

Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Aprenda a concentrar e extrair metabólitos de comunidades fitoplanctônicas de baixa densidade para metabolômica ambiental utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Este método permite analisar perfis metabólicos em amostras naturais e experimentais.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

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