Name: Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a concentrar e extrair metabólitos de comunidades fitoplanctônicas de baixa densidade para metabolômica ambiental utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Este método permite analisar perfis metabólicos em amostras naturais e experimentais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Grants-in-Aid para a Investigação Científica para impugnar pesquisa exploratória (JK), e da Investigação Científica (A) (JK e SM) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão . A Riken FPR comunhão (RCE) forneceu apoio adicional. Os autores expressam sua gratidão para com os drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto para assistência técnica com RMN e análises estatísticas.

1. Preparação filtro para remover Extraíveis <ol><li> Use 25-mm de diâmetro de poro de 0,22 um tamanho de filtros PVDF Durapore hidrofílico (Millipore). Coloque filtros em uma proveta de 500 ml limpa Pyrex usando uma pinça. Pré-lavagem três vezes com água destilada. Redemoinho bem como de enxaguar para impedir que os filtros se colem umas às outras. Adicionar 300 ml Milli-Q (Millipore) ou de água de alta qualidade equivalente. Autoclavar para facilitar a remoção completa de extraíveis a partir dos filtros. </li><li> Decantar a Milli-Q e novamente tripla lavagem dos filtros, desta vez com Milli-Q. O uso de filtros lugar pinças individuais sobre uma superfície limpa e seca (tal como folha de alumínio) e, ou seca a uma temperatura razoável (por exemplo 37 ° C) ou de ar seco. Os filtros agora está pronto para usar. </li></ol> 2. A filtração do material de amostra <ol><li> Para demonstrar este protocolo, a Millipore aço inoxidável 3 º lugar-tubo do filtro com colunas de 25 mm de microanálise de filtros de vidro com suportee uma bomba mecânica é utilizada. Utilizando uma técnica asséptica, colocar um filtro de 25 mm único na base da coluna de filtro, aplicar a coluna e pinça juntos. </li><li> Carregar 15 ml de amostra na coluna, abrir o obturador sobre o tubo do filtro, e ligar a bomba. Filtrar sob pressão suave para minimizar a quebra das células (&lt;kPa 5). Outras bombas, tais como mão ou uma bomba peristáltica podem ser adaptados a este protocolo. Para amostras de densidade mais baixa, adições sucessivas de água pode ser necessário, não deixe o filtro ficar seca por um período prolongado de tempo entre as adições de água. </li><li> Para amostras marinhas, depois de ter filtrado a sua amostra, você pode realizar uma de água doce opcional enxágüe para reduzir os íons paramagnéticos residuais em sua amostra e no filtro. Isso pode ajudar com mais ajuste preciso do magneto do espectrômetro. Simplesmente suavemente adicionar um pequeno volume de água e filtrar através de sua amostra recolhida no final. </li><li> Uma vez que a filtragem está terminado, desligue a bomba e deixar o ope válvulan por isso ainda há a pressão negativa sob o filtro. Remover o grampo e coluna de filtro. </li><li> Com uma mão, use uma pinça limpa para tomar posse do filtro. Dobre o filtro em si, mas não prega. Com a outra mão use o lábio de um tubo de microcentrífuga estéril 2-ml para segurar o filtro. Solte as pinças, em seguida, usá-los para voltar a agarrar ambas as bordas do filtro. Regrip em um ângulo de 45 ° ao redil. </li><li> Colocar o filtro para dentro do tubo 2-ml e libertação de modo que se abre com o lado da amostra virada para dentro. Você pode colocar até dois filtros para o tubo de microcentrífuga estéril 2 ml desta forma. Se usando dois filtros, assegurar que eles se sobrepõem tão pouco quanto possível. Imediatamente congelar (pelo menos -30 ° C). </li></ol> 3. Extracção do aquosa solúveis em metabolitos <ol><li> Liofilizar suas amostras durante a noite ou por pelo menos 10 horas. </li><li> Após liofilização, adicionar um triturador de aço inoxidável a cada tubo (Tokken). Adicionar 750 ul de potássio padronizadatampão fosfato de RMN em óxido de deutério (2 H&gt; 90%) com 2,2-Dimetil-2-silapentane-5-sulfonato de (DSS) padrão (KPI; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM de K 2 HPO 4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% de D 2 O) 2. </li><li> Sonicar as amostras durante 5 minutos a 4 ° C num sonicador água (Bioruptor, Diagenode) para remover o material celular a partir do filtro. Remover os filtros com pinças limpas. </li><li> Dissociação das células utilizando um triturador de moinho (1600 rpm) durante 5 minutos. </li><li> Incubar a 65 ° C com agitação (1400 rpm) num agitador de bancada (Eppendorf) durante 15 minutos. </li><li> Remover o porco de metal com uma pinça limpas, e centrifugar a amostra a 13.000 g durante 5 minutos. </li><li> Colhem-se o sobrenadante directamente para um tubo de RMN para espectroscopia de RMN. </li></ol> 4. Espectroscopia de RMN e Análise de Dados <ol><li> Carregue o seu exemplo em um espectrômetro de RMN (aqui, um Bruker DRX-500 equipado com espectrômetroTXI sonda com triplo-eixo gradiente controlado por um computador que executa Xwin-RMN). </li><li> 1D obter 1 H espectros de RMN utilizando métodos adequados previamente publicados 2,15 a partir da interface Xwin-RMN. No presente estudo 1 H espectros de RMN foram registados num espectrómetro de funcionamento DRX-500 em 500,03 MHz a 298 K. sinais de água residuais foram suprimida pela sequência de pulso Watergate, com um tempo de repetição de 1,2 s. 128 transientes foram coletadas para obter 32.000 pontos de dados por espectro. </li><li> Transfira os diretórios de dados de RMN para um PC instalado NMRPipe software 16. Processar os dados brutos e DSS definir como 0 ppm de referência, em seguida, manualmente fase do espectro. Digitalizar os dados espectrais em um conjunto de valores discretos, integrando ou "binning-los" com softwares como o rNMR, Automics, ou usando o pacote FT2B publicamente disponível no site da ECOMICS ( <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. Em diaé exemplo, os espectros foram integrados entre 0,5 e 10,5 ppm ao longo de 0,032 ppm regiões integral usando ECOMICS e normalizado para tanto DSS ou a intensidade do sinal total. Os dados de saída agora pode ser usado para análise estatística jusante, tais como análise de componentes principais (PCA), utilizando softwares livres como o R 18. </li></ol> 5. Os resultados representativos Um exemplo de um espectros de RMN H obtidos utilizando os métodos acima são mostrados na Figura 1. Estas amostras, a partir de dois pontos de tempo de uma experiência de microcosmos mostram diferenças claras devido a algas actividades metabólicas. O espectro de 4 dias mostra abundância considerável de picos, particularmente na gama de 3-4 ppm em comparação com a amostra de 1 dia. Estes picos pode ser atribuída aos açúcares produzidos por floração diatomáceas dentro do microcosmo. Em um experimento semelhante comparando o crescimento de comunidades naturais de plâncton na água do mar artificial ou natural, abordagens estatísticas such como principal componente trama pontuação análise (PCA) derivado a partir de espectros de RMN binned pode ser usado para mostrar claras diferenças metabólicas entre os dois tratamentos (Fig. 2), enquanto que as parcelas de carregamento pode identificar picos dentro do espectro que forma a distribuição dos dados . Tais resultados podem ser comparados com dados de outros níveis ómicas, tais como a partir de métodos de impressão digital genómicas (Fig. 3). Estes picos de RMN podem ser consultados individualmente (por exemplo, no BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ) 19, ou espectros inteiro pode ser analisados ​​estatisticamente (por exemplo, com SpinAssign em <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. jp / ação? = nmr_search</a> ) 2. Neste exemplo, as diferenças entre tratamentos foram devido a uma abundância de picos na região açúcares (3,39 ppm para 4,04 ppm) dos espectros de metabolitos naturais da comunidade de plâncton, e vários picos característicos para as comunidades água do mar artificial foram tentativamente identified como de lactato e formiato usando SpinAssign. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Representativas 1 H espectros de RMN obtido a partir de amostras processadas usando este procedimento. As amostras foram tomadas antes microcosmos (dia 1) e durante (dia 4) bloom de diatomáceas uma intensa. Experiências de RMN foram realizadas num Bruker DRX-500 com sinais normalizados para a altura do pico do padrão interno (DSS; 0 ppm). <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Análise de Componentes Principais enredo pontuação (PCA) para espectros de RMN de binned metabolomes das comunidades microbianas de origem natural planctônicas cultivadas em microcosmos com naturais (diamantes abertos) ou água do mar artificial (círculos pretos). Limpar diferenças metabólicas pode ser observado no diagrama de dispersão. Um gráfico de carregamento de uma tal análise pode então ser usado para identificar picos distintos de importância nao sistema; estes picos pode ser ainda analisada conforme necessário. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 3"> Figura 3. Um exemplo de multi-omics análise combinando RMN com os dados genéticos. Composição da comunidade com base na electroforese em gel com gradiente desnaturante de 18S (esquerda) e 16S (direita) de genes de rRNA das mesmas amostras como analisados ​​na Figura 2 também mostra os padrões de microbianas distintas da comunidade entre naturais (diamantes abertos) e microcosmos artificiais (círculos pretos) de água do mar. Essa correspondência entre metaboloma e genoma dos sistemas naturais demonstra a utilidade dessa abordagem.

<ol><li>Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+metabolomics%3A+a+critical+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives.</a> Metabolomics. 5, 3-21 (2008).</li>
<li>Chikayama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+indices+for+simultaneous+large-scale+metabolite+detections+for+a+single+NMR+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum.</a> Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).</li>
<li>Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rNMR%3A+open+source+software+for+identifying+and+quantifying+metabolites+in+NMR+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Chem%22%5BJournal%5D)">rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra.</a> Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+gut+microbes+modulate+human+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).</li>
<li>Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+exploration+of+metabolic+and+genomic+diversity+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice.</a> BMC Genomics. 10, 568(2009).</li>
<li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacteria+can+protect+from+enteropathogenic+infection+through+production+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate.</a> Nature. 469, 543-547 (2011).</li>
<li>Kikuchi, J., Hirayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+stable+isotope+labeling+of+higher+plants+for+a+hetero-nuclear+multi-dimensional+NMR-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics.</a> Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).</li>
<li>Martin, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+top-down+systems+biology+view+of+microbiome-mammalian+metabolic+interactions+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model.</a> Mol. Syst. Biol. 3, 112(2007).</li>
<li>Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+lipid+profiling+of+mycobacteria+using+2D+HSQC+NMR+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps.</a> J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).</li>
<li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+characterization+of+bacterial+metabolic+dynamics+with+a+novel+profiling+technique%2C+real-time+metabolotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping.</a> PloS ONE. 4, e4893(2009).</li>
<li>Date, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+monitoring+approach+for+metabolic+dynamics+in+microbial+ecosystems+using+stable-isotope-labeling+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies.</a> J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).</li>
<li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+omics+approach+identifies+nutrition-mediated+microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions.</a> J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).</li>
<li>Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogeochemical+controls+and+feedbacks+on+ocean+primary+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production.</a> Science. 281, 200-207 (1998).</li>
<li>Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+aquatic+organisms%3A+the+new+%27omics%27+on+the+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Ecol.+Prog.+Ser%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).</li>
<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+semipolar+solvent+system+as+a+step+toward+heteronuclear+multidimensional+NMR-based+metabolomics+for+13C-labeled+bacteria%2C+plants%2C+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals.</a> Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).</li>
<li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMRPipe%3A+A+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+UNIX+pipes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.</a> J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automics%3A+an+integrated+platform+for+NMR-based+metabonomics+spectral+processing+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis.</a> BMC Bioinformatics. 10, 83(2009).</li>
<li>The R Project for Statistical Computing. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> (2010).</li>
<li>Eldon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).</li>
<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+polar+and+semipolar+plant+metabolites+throughout+extraction+processes+using+a+combined+solution-state+and+high-resolution+magic+angle+spinning+NMR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach.</a> Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de extração e filtração metabólito demonstrado aqui permite a biomassa microbiana planctônica a ser coletadas em quantidade suficiente para metabolômica RMN. Enquanto a extracção apenas de solução aquosa solúveis em metabolitos usando KPi e 1D 1 H RMN é demonstrado, outros solventes de extracção e abordagens espectroscópicas pode ser usado. Um exemplo útil é a utilização de metanol deuterado como solvente semi-polar, que tem sido mostrado para produzir espectros de RMN superiores a partir de amostras...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 0,22 hidrofílicos Durapore filtros PVDF, 25 mm </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Titular Microanálise do filtro, 25 mm, de frita de vidro suporte </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3 º lugar-colector, 47 mm, em aço inoxidável </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Wako </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> Óxido de deutério, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge Isotope Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> Trituradores de aço inox incluído </td></tr><tr><td> Thermomixer conforto </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> Evaporador de vácuo </td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> NMR </td><td> Bruker </td><td> DRX-500 com 5 mm de sonda TXI </td><td></td></tr><tr><td> Ferramenta binning Spectral </td><td> Originalmente desenvolvido </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> Ferramenta de anotação de metabólitos e banco de dados </td><td> Originalmente desenvolvido </td><td> SpinAssign </td><td>= Nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para metabolomics ambiental utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Metabolômica Ambiental é um campo emergente que está promovendo uma nova compreensão de como os organismos respondem e interagem com o ambiente e entre si, no nível bioquímico 1. Nuclear espectroscopia de ressonância magnética (RNM) é uma de várias tecnologias, incluindo cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), com a promessa considerável para tais estudos. Vantagens de RMN são de que ele é adequado para análises não-alvo, fornece informações estruturais e espectros podem ser consultados de maneira quantitativa e estatística em bancos de dados recentemente disponíveis de espectros metabólito indivíduo 2,3. Além disso, dados espectrais de RMN podem ser combinados com dados de outros níveis genómica (transcritômica por exemplo, genómica) para fornecer uma compreensão mais abrangente das respostas fisiológicas de taxa para o outro e ao meio ambiente 4,5,6. No entanto, de RMN é menos sensível do que outras técnicas de metabolômica, tornando difícil a APply para sistemas microbianos naturais, onde as populações de amostras podem ser concentrações de baixa densidade e metabólito baixo em comparação com metabólitos de bem-definida e facilmente extraíveis fontes, tais como tecidos inteiros, fluidos biológicos ou de células-culturas. Por conseguinte, os poucos estudos directos ambientais metabolômica de micróbios realizadas até à data têm sido limitados a cultura à base de ou facilmente definido de alta densidade, tais como os ecossistemas hospedeiro simbióticas-sistemas, construídos co-culturas ou manipulações do ambiente intestino, onde rotulagem isótopo estável pode ser adicionalmente utilizado para aumentar os sinais de RMN 7,8,9,10,11,12. Métodos que facilitam a concentração e recolha de metabolitos ambientais em concentrações adequadas para RMN faltam. Uma vez que a atenção recente tem sido dada aos metabolômica ambientais de organismos dentro do meio aquático, onde a maior parte do fluxo de energia e material é mediada pela comunidade planctônicas 13,14, desenvolvemos um método para a concentraçãoção e extração de todo-comunidade metabólitos de sistemas microbianos planctônicos por filtração. Hidrofílicos disponíveis comercialmente poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF) os filtros são especialmente tratado para remover completamente os extraíveis, que podem de outro modo aparecem como contaminantes em análises subsequentes. Estes filtros tratados são então usados ​​para filtrar amostras ambientais ou experimental de interesse. Filtros contendo o material da amostra molhada são liofilizadas e aquosa solúveis em metabolitos são extraídos directamente para a espectroscopia de RMN convencional, utilizando um tampão de extracção padronizados de potássio fosfato 2. Os dados derivados desses métodos podem ser analisados ​​estatisticamente para identificar padrões significativos, ou integrados com outros níveis genómica para compreensão abrangente da comunidade e função do ecossistema.

Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

A metabolômica ambiental é um campo emergente que está promovendo novas compreensões sobre como os organismos respondem e interagem com o ambiente e entre si...

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear oferece diversas vantagens distintas para pesquisas de metabolômica ambiental, mas é relativamente insensível neste procedimento. É relatado um método de filtração para a concentração e extração de metabólitos de comunidades inteiras a partir de sistemas platônicos adequados para RMN. Isso é realizado primeiramente preparando-se filtros especialmente para a coleta de amostras mediante a remoção de substâncias extraíveis.O segundo passo do procedimento é filtrar a amostra, natural ou experimental, sobre os filtros. O terceiro passo do procedimento é fixar o material da amostra e extrair os metabólitos. O passo final do procedimento é analisar as amostras utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear e integrar os dados conforme apropriado.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram alterações metabólicas em amostras naturais ao longo de gradientes ambientais ou em resposta a manipulações experimentais, por meio das abordagens de metabolômica e transams. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a centrifugação, é que a comunidade total pode ser amostrada e volumes maiores de amostra são possíveis para amostras de baixa densidade. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de metalômica ambiental, como a forma como o crescimento microbiano responde a mudanças ambientais. A demonstração do procedimento será realizada por Stage e From, do meu laboratório.Inicie este Protocolo colocando os filtros em um béquer Pyrex limpo de 500 mililitros usando pinças. Cubra os filtros com água destilada para pré-lavar, agitando bem para evitar que os filtros grudem uns nos outros. Descarte a água e repita a lavagem duas vezes.Após a lavagem final, adicione 300 mililitros de água Milli Q ao béquer e autóclave os filtros. Depois que os filtros tiverem sido autoclavados, descarte a água Milli Q e lave os filtros três vezes como antes, utilizando água Milli Q.Coloque os filtros individuais sobre uma superfície limpa e seca, como folha de alumínio, com pinça, e seque-os a uma temperatura razoável. Por exemplo, a 37 graus ou em temperatura ambiente, os filtros estão agora prontos para serem utilizados na demonstração deste protocolo. Utiliza-se um manifold de filtração de aço inoxidável Millipore com três posições, equipado com colunas de filtração microanalítica de 25 milímetros com suportes de vidro e uma bomba mecânica, empregando técnica asséptica.Coloque um único filtro de 25 milímetros na base da coluna de filtração. Aplique a coluna e prenda o aparato firmemente. Carregue 15 mililitros da amostra aqui obtida de um microcosmo com alto teor de nutrientes na coluna.Abra a válvula de retenção no conjunto de filtração e ligue o filtro da bomba com pressão suave para minimizar a ruptura celular. Para amostras de menor densidade, podem ser necessárias adições sucessivas de água. Tenha cuidado para não deixar o filtro secar por um período prolongado entre as adições de água.Dois, reduza os sais paramagnéticos residuais de amostras marinhas e uma lavagem opcional com água doce pode ser realizada. Após a conclusão da filtração, desligue a bomba e mantenha a válvula aberta para que ainda haja pressão negativa sob o filtro. Remova o grampo e a coluna de filtração com uma das mãos.Use pin&ccedil;as limpas para segurar o filtro. Dobre o filtro sobre si mesmo, mas n&atilde;o fa&ccedil;a dobras com a outra m&atilde;o. Use a borda de um tubo est&eacute;ril de microcentrifuga&ccedil;&atilde;o de dois mililitros para manter o filtro pressionado.Coloque o filtro no tubo de dois mililitros e solte-o para que se abra com o lado da amostra voltado para dentro. Congele imediatamente em nitrogênio líquido para extrair os metabólitos solúveis em água. Primeiro, liofilize as amostras durante a noite ou por pelo menos 10 horas; após a liofilização, adicione um triturador de aço inoxidável a cada tubo fino.Adicione 750 microlitros de tampão padronizado de fosfato de potássio e óxido de deutério com padrão DSS. Sonique as amostras por cinco minutos a quatro graus em banho de ultrassom para remover o material celular do filtro. Remova os filtros com pinças limpas.Desintegre as células usando um moinho triturador a 1600 RPM durante cinco minutos. Em seguida, incube a 65 graus Celsius. Agite em um agitador de bancada por 15 minutos.Após a incubação, remova o triturador metálico com pinças limpas. Centrifugue a amostra a 13.000 G durante cinco minutos. Após a centrifugação, retire o sobrenadante e transfira-o diretamente para um tubo de RMN para espectroscopia por RMN.Carregue a amostra no espectrômetro de RMN aqui. As amostras são analisadas em um espectrômetro Bruker DRX 500 equipado com sonda TXI com gradiente triplo e operando a 298 Kelvin. Faça o travamento, ajuste e shim do ímã.Obtenha espectros de RMN de 1D de prótons utilizando a interface top spin e métodos previamente descritos ou utilize outros softwares de interface de espectrômetro conforme necessário. Aqui, os espectros foram adquiridos com supressão dos sinais residuais de água pela sequência de pulsos Watergate com um tempo de repetição de 1,2 segundos. No exemplo presente, 128 transientes foram coletados para cada amostra.Transfira os diretórios de dados de RMN para um computador pessoal com o software NMR pipe instalado. Processe os dados brutos, defina o sinal de DSS como referência zero em ppm e, em seguida, faça a fase manual dos espectros. Digitalize os dados espectrais por agrupamento utilizando o pacote FT two B de domínio público disponível no site de comércio eletrônico.Outros utilitários de software, como RNMR ou Atomics, também podem ser usados para bin.Bin. Os dados podem ser normalizados em relação ao sinal total ou ao sinal de DSS para mostrar alterações proporcionais dos sinais entre amostras. Os dados resultantes podem agora ser utilizados para análises estatísticas posteriores, como análise de componentes principais ou PCA, usando pacotes de software gratuitos como o R, conforme mostrado.Aqui está um exemplo de espectros de RMN de prótons obtidos utilizando o procedimento demonstrado. Os espectros são de dois pontos temporais de um experimento de microcosmo e mostram diferenças claras devido às atividades metabólicas das algas. O espectro do dia quatro mostra abundância considerável de picos, particularmente na faixa das três às 16:00, em comparação com a amostra do dia um.Esses picos podem ser atribuídos a açúcares produzidos por diatomáceas em floração dentro do microcosmo. Em um experimento semelhante, um gráfico de escores de ACP derivado da curvatura em Mr.Spectra, mostrando os dois primeiros componentes principais, foi utilizado para comparar o crescimento de comunidades naturais de plâncton em água do mar artificial e natural. Essa abordagem estatística reduz dados multidimensionais a um formato mais simples, aqui bidimensional, revelando de maneira direta a estrutura nos pontos de dados subjacentes próximos.Um ou ambos os eixos são mais semelhantes aqui. Podem ser observadas diferenças metabólicas claras entre os dois tratamentos. Os dados deste experimento foram utilizados para realizar uma análise de múltiplos ômicas.Combinando a RMN com dados genômicos, a composição da comunidade microbiana com base na eletroforese em gradiente desnaturante de genes 18S e 16S-R-RN-A também revela padrões distintos de comunidades microbianas entre microcosmos de água do mar natural e artificial. Essa correspondência entre metaboloma e genoma em sistemas naturais demonstra a utilidade dessa abordagem. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de empregar uma técnica apropriada para minimizar a contaminação durante a execução do protocolo.Outros métodos, como análises de criação com níveis de ômicas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como o microbioma se correlaciona com certos metabólitos.

concentration-metabolites-from-low-density-planktonic-communities-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um procedimento de colonização progressiva é descrito para melhor avaliar seu impacto sobre o metabolismo hepático host. Colonização é monitorado não invasiva através da avaliação da excreção urinária de microbiana co-metabólitos por RMN baseado em perfil metabólico, enquanto o metabolismo hepático é avaliado pela Alta Resolução Magia Angle Spinning (MAS HR) NMR perfil da biópsia intacta.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

A neuroquímica do cérebro de mamíferos é alterada em muitas doenças neurológicas e sistêmicas. Perfis característicos de metabólitos cerebrais podem ser obtidos com eficiência com base em extratos brutos de tecido cerebral. Para isso, é empregada espectroscopia de RMN de alta resolução, permitindo uma análise quantitativa detalhada das concentrações de metabólitos (metabolômica).

Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

Aqui, de alta resolução de 1 H e 13 C de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi usada como uma ferramenta rápido e fiável para a análise quantitativa e qualitativa dos suplementos de óleo de peixe encapsulado.

Espectroscopia de RMN como uma ferramenta robusta para a avaliação rápida do perfil lipídico do óleo de peixes suplementa

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Este protocolo descreve uma única taxa de transferência de técnicas complementares, analíticas e omics, culminando em uma caracterização-pareado de matéria orgânica natural e proteomics microbiana nos diferentes ecossistemas. Esta abordagem permite comparações robustas para a identificação de vias metabólicas e transformações importantes para descrever a produção de gás de efeito estufa e prevendo respostas a mudanças ambientais.

Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Este artigo apresenta o uso de PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE no perfil metabólico de plantas e inclui procedimentos detalhados para preparação de amostras e registro ideal de espectros de RMN Pure Shift. Exemplos através dos quais o ganho de resolução alcançado pelo desacoplamento homonuclear permite uma compreensão mais abrangente do sistema são discutidos.

Ressonância magnética nuclear de deslocamento puro: uma nova ferramenta para metabolômica de plantas

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é usada para identificar desregulação nos metabólitos em pacientes com várias doenças. Essa técnica permite a quantificação dos metabólitos perturbados, desvendando os insights fisiopatológicos. Aqui, descrevemos o procedimento passo a passo da abordagem baseada em RMN para a caracterização metabólica dos pacientes.

Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Este protocolo visa preservar metabólitos celulares para espectrometria de massa de célula única (SCMS), combinando lavagem de solução salina volátil, têmpera rápida de nitrogênio líquido, liofilização e armazenamento de -8 °C. Isso demonstra que a extinção do nitrogênio líquido é essencial para manter os perfis de metabólitos, enquanto o armazenamento refrigerado prolongado deve ser minimizado para evitar alterações metabólicas.

Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Aprenda a concentrar e extrair metabólitos de comunidades fitoplanctônicas de baixa densidade para metabolômica ambiental utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Este método permite analisar perfis metabólicos em amostras naturais e experimentais.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Explorar mais vídeos