Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
7 de abril de 2012
Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear oferece diversas vantagens distintas para pesquisas de metabolômica ambiental, mas é relativamente insensível neste procedimento. É relatado um método de filtração para a concentração e extração de metabólitos de comunidades inteiras a partir de sistemas platônicos adequados para RMN. Isso é realizado primeiramente preparando-se filtros especialmente para a coleta de amostras mediante a remoção de substâncias extraíveis.
O segundo passo do procedimento é filtrar a amostra, natural ou experimental, sobre os filtros. O terceiro passo do procedimento é fixar o material da amostra e extrair os metabólitos. O passo final do procedimento é analisar as amostras utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear e integrar os dados conforme apropriado.
Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram alterações metabólicas em amostras naturais ao longo de gradientes ambientais ou em resposta a manipulações experimentais, por meio das abordagens de metabolômica e transams. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a centrifugação, é que a comunidade total pode ser amostrada e volumes maiores de amostra são possíveis para amostras de baixa densidade. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de metalômica ambiental, como a forma como o crescimento microbiano responde a mudanças ambientais. A demonstração do procedimento será realizada por Stage e From, do meu laboratório.
Inicie este Protocolo colocando os filtros em um béquer Pyrex limpo de 500 mililitros usando pinças. Cubra os filtros com água destilada para pré-lavar, agitando bem para evitar que os filtros grudem uns nos outros. Descarte a água e repita a lavagem duas vezes.
Após a lavagem final, adicione 300 mililitros de água Milli Q ao béquer e autóclave os filtros. Depois que os filtros tiverem sido autoclavados, descarte a água Milli Q e lave os filtros três vezes como antes, utilizando água Milli Q.
Coloque os filtros individuais sobre uma superfície limpa e seca, como folha de alumínio, com pinça, e seque-os a uma temperatura razoável. Por exemplo, a 37 graus ou em temperatura ambiente, os filtros estão agora prontos para serem utilizados na demonstração deste protocolo. Utiliza-se um manifold de filtração de aço inoxidável Millipore com três posições, equipado com colunas de filtração microanalítica de 25 milímetros com suportes de vidro e uma bomba mecânica, empregando técnica asséptica.
Coloque um único filtro de 25 milímetros na base da coluna de filtração. Aplique a coluna e prenda o aparato firmemente. Carregue 15 mililitros da amostra aqui obtida de um microcosmo com alto teor de nutrientes na coluna.
Abra a válvula de retenção no conjunto de filtração e ligue o filtro da bomba com pressão suave para minimizar a ruptura celular. Para amostras de menor densidade, podem ser necessárias adições sucessivas de água. Tenha cuidado para não deixar o filtro secar por um período prolongado entre as adições de água.
Dois, reduza os sais paramagnéticos residuais de amostras marinhas e uma lavagem opcional com água doce pode ser realizada. Após a conclusão da filtração, desligue a bomba e mantenha a válvula aberta para que ainda haja pressão negativa sob o filtro. Remova o grampo e a coluna de filtração com uma das mãos.
Use pinças limpas para segurar o filtro. Dobre o filtro sobre si mesmo, mas não faça dobras com a outra mão. Use a borda de um tubo estéril de microcentrifugação de dois mililitros para manter o filtro pressionado.
Coloque o filtro no tubo de dois mililitros e solte-o para que se abra com o lado da amostra voltado para dentro. Congele imediatamente em nitrogênio líquido para extrair os metabólitos solúveis em água. Primeiro, liofilize as amostras durante a noite ou por pelo menos 10 horas; após a liofilização, adicione um triturador de aço inoxidável a cada tubo fino.
Adicione 750 microlitros de tampão padronizado de fosfato de potássio e óxido de deutério com padrão DSS. Sonique as amostras por cinco minutos a quatro graus em banho de ultrassom para remover o material celular do filtro. Remova os filtros com pinças limpas.
Desintegre as células usando um moinho triturador a 1600 RPM durante cinco minutos. Em seguida, incube a 65 graus Celsius. Agite em um agitador de bancada por 15 minutos.
Após a incubação, remova o triturador metálico com pinças limpas. Centrifugue a amostra a 13.000 G durante cinco minutos. Após a centrifugação, retire o sobrenadante e transfira-o diretamente para um tubo de RMN para espectroscopia por RMN.
Carregue a amostra no espectrômetro de RMN aqui. As amostras são analisadas em um espectrômetro Bruker DRX 500 equipado com sonda TXI com gradiente triplo e operando a 298 Kelvin. Faça o travamento, ajuste e shim do ímã.
Obtenha espectros de RMN de 1D de prótons utilizando a interface top spin e métodos previamente descritos ou utilize outros softwares de interface de espectrômetro conforme necessário. Aqui, os espectros foram adquiridos com supressão dos sinais residuais de água pela sequência de pulsos Watergate com um tempo de repetição de 1,2 segundos. No exemplo presente, 128 transientes foram coletados para cada amostra.
Transfira os diretórios de dados de RMN para um computador pessoal com o software NMR pipe instalado. Processe os dados brutos, defina o sinal de DSS como referência zero em ppm e, em seguida, faça a fase manual dos espectros. Digitalize os dados espectrais por agrupamento utilizando o pacote FT two B de domínio público disponível no site de comércio eletrônico.
Outros utilitários de software, como RNMR ou Atomics, também podem ser usados para bin.Bin. Os dados podem ser normalizados em relação ao sinal total ou ao sinal de DSS para mostrar alterações proporcionais dos sinais entre amostras. Os dados resultantes podem agora ser utilizados para análises estatísticas posteriores, como análise de componentes principais ou PCA, usando pacotes de software gratuitos como o R, conforme mostrado.
Aqui está um exemplo de espectros de RMN de prótons obtidos utilizando o procedimento demonstrado. Os espectros são de dois pontos temporais de um experimento de microcosmo e mostram diferenças claras devido às atividades metabólicas das algas. O espectro do dia quatro mostra abundância considerável de picos, particularmente na faixa das três às 16:00, em comparação com a amostra do dia um.
Esses picos podem ser atribuídos a açúcares produzidos por diatomáceas em floração dentro do microcosmo. Em um experimento semelhante, um gráfico de escores de ACP derivado da curvatura em Mr.Spectra, mostrando os dois primeiros componentes principais, foi utilizado para comparar o crescimento de comunidades naturais de plâncton em água do mar artificial e natural. Essa abordagem estatística reduz dados multidimensionais a um formato mais simples, aqui bidimensional, revelando de maneira direta a estrutura nos pontos de dados subjacentes próximos.
Um ou ambos os eixos são mais semelhantes aqui. Podem ser observadas diferenças metabólicas claras entre os dois tratamentos. Os dados deste experimento foram utilizados para realizar uma análise de múltiplos ômicas.
Combinando a RMN com dados genômicos, a composição da comunidade microbiana com base na eletroforese em gradiente desnaturante de genes 18S e 16S-R-RN-A também revela padrões distintos de comunidades microbianas entre microcosmos de água do mar natural e artificial. Essa correspondência entre metaboloma e genoma em sistemas naturais demonstra a utilidade dessa abordagem. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de empregar uma técnica apropriada para minimizar a contaminação durante a execução do protocolo.
Outros métodos, como análises de criação com níveis de ômicas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como o microbioma se correlaciona com certos metabólitos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para extrair metabólitos de comunidades microbianas planctônicas utilizando espectroscopia por ressonância magnética nuclear. O procedimento envolve filtração sobre filtros especialmente preparados, liofilização e subsequente extração de metabólitos solúveis em água, facilitando estudos de metagenômica ambiental.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Metabolômica Ambiental
- Ecologia Microbiana
- Ressonância Magnética Nuclear
Contexto
- A extração de metabólitos é crucial para o estudo de comunidades microbianas.
- A espectroscopia de ressonância magnética nuclear fornece informações sobre a composição dos metabólitos.
- Métodos de filtração aumentam a concentração de metabólitos provenientes de amostras.
- Essa abordagem pode ser aplicada tanto a sistemas microbianos naturais quanto experimentais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para extração de metabólitos de comunidades microbianas planctônicas.
- Permitir a análise detalhada de metabólitos utilizando espectroscopia por RMN.
- Avançar o campo da metabolômica ambiental.
Métodos Utilizados
- Preparação de filtros para remoção de substâncias extraíveis.
- Filtração de amostras microbianas em filtros preparados.
- Liofilização do material da amostra.
- Extração de metabólitos solúveis em água para análise.
Resultados Principais
- O método concentra e extrai com sucesso metabólitos de comunidades microbianas.
- A espectroscopia de RMN analisa eficazmente os metabólitos extraídos.
- A abordagem é aplicável a amostras naturais e experimentais.
- Os resultados contribuem para o entendimento dos perfis metabólicos de comunidades microbianas.
Conclusões
- Este método aprimora o estudo da metabolômica microbiana.
- Ele fornece uma estrutura para pesquisas futuras em metabolômica ambiental.
- Aplicações adicionais podem levar a descobertas sobre interações e funções microbianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A metabolômica ambiental enfrenta desafios de sensibilidade ao estudar comunidades microbianas de baixa densidade, limitando a aplicabilidade da RMN em fluxos de trabalho de descoberta inicial. Este método de concentração baseado em filtração permite o perfilhamento não direcionado de metabólitos a partir de sistemas planctônicos, apoiando a geração de hipóteses em ecologia microbiana e a exploração translacional de biomarcadores. Ao melhorar a detectabilidade de metabólitos, a abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas para aplicações em saúde ambiental.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao capturar alterações nos metabólitos de toda a comunidade em resposta a estímulos ambientais.
- Valor Operacional: Fornece protocolos padronizados de preparação de filtros e lise para reduzir a variabilidade técnica na extração de metabólitos.
- Valor Estratégico: Apoia a triagem de portfólios por meio da detecção reprodutível de biomarcadores de metabólitos associados a vias de estresse ou adaptação microbiana.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem por RMN em etapas subsequentes, concentrando metabólitos solúveis em água a partir de amostras de baixa densidade.
- Valor Operacional: Garante a padronização do ensaio por meio da liofilização e extração com tampão fosfato de potássio, melhorando a reprodutibilidade entre as execuções.
- Valor Estratégico: Aumenta a prontidão para triagem em estudos dos efeitos de compostos em modelos de co-cultivo microbiano ou comunidades sintéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao permitir a correlação entre metaboloma e genoma em microcosmos de água do mar natural e artificial.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade translacional por meio da integração multi-ômica, vinculando espectros de metabólitos aos dados de composição comunitária genômica.
- Valor Estratégico: Auxilia na tomada de decisões com ajuste de risco ao identificar assinaturas metabólicas consistentes ao longo de gradientes ambientais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir testes de hipóteses em sistemas microbianos, prossegue para triagem por meio de extração padronizada de metabólitos e apóia pesquisas translacionais por meio do alinhamento de dados multi-ômicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao detectar alterações nos metabólitos em comunidades planctônicas sob diferentes manipulações experimentais.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e resultados quantitativos por meio de concentrações de metabólitos detectáveis por RMN após filtração e lise.
- Análise: Gera dados espectrais adequados para análises estatísticas, como a ACP, permitindo comparação entre condições e reconhecimento de padrões.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da correspondência entre metaboloma e genoma em sistemas naturais, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de filtração e extração aplicável a diversos modelos microbianos aquáticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas respostas a metabólitos microbianos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio do pré-tratamento com filtro e etapas automatizadas de lise.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao fornecer perfis reprodutíveis de metabólitos para desvio de riscos biológicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco mediante alterações detectáveis nos metabólitos associadas a fenótipos de crescimento ou estresse microbiano.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas de filtração, liofilização e preparação de amostras para RMN para evitar contaminação e garantir a recuperação de metabólitos.
- Depende do acesso a espectrômetros de RMN com capacidade de supressão de sinal da água e software para processamento e agrupamento espectral.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de manuseio de filtros, buffers de extração e protocolos de normalização de dados para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para densidades amostrais variáveis, exigindo filtrações sequenciais ou ajustes de volume para comunidades de baixa abundância.
- Inclui limitações práticas, como interferência de sais paramagnéticos residuais em amostras marinhas, exigindo etapas opcionais de lavagem para manter a qualidade espectral.
