Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear oferece várias vantagens distintas para a pesquisa metabolômica ambiental, mas é relativamente insensível neste procedimento. Um método de filtração para a concentração e extração de metabólitos de toda a comunidade de sistemas platônicos adequados para RMN é relatado. Isso é feito primeiro preparando especialmente os filtros para coleta de amostras, removendo os extraíveis.

A segunda etapa do procedimento é filtrar a amostra, natural ou experimental, nos filtros. A terceira etapa do procedimento é lifealizar o material da amostra e extrair metabólitos. A etapa final do procedimento é analisar as amostras usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear e integrar os dados conforme apropriado.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças metabólicas em amostras naturais em gradientes ambientais ou em resposta a manipulações experimentais por meio de abordagens metabolômicas e transams. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a centrifugação, é que a comunidade total pode ser amostrada e volumes de amostra maiores são possíveis para amostras de baixa densidade. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo ambiental da mistura de metais, como a forma como o microcrescimento responde às mudanças ambientais, demonstrando que o procedimento será estágio e do meu laboratório.

Comece este protocolo colocando filtros em um alto-falante Pyrex limpo de 500 mililitros usando uma pinça. Cubra o filtro com água destilada para pré-enxaguar bem o redemoinho para evitar que os filtros grudem uns nos outros. Despeje a água e repita o enxágue duas vezes.

Após o enxágue final, adicione 300 mililitros de água Milli Q ao béquer e autoclave os filtros. Uma vez que os filtros tenham sido autoclavados. Despeje a água milli Q e enxágue três vezes os filtros como antes, exceto use Milli Q Water.

Coloque os filtros individuais em uma superfície limpa e seca, como papel alumínio com uma pinça seca a uma temperatura razoável. Por exemplo, a 37 graus ou seco ao ar, os filtros agora estão prontos para uso para demonstrar este protocolo. Um coletor de filtro de três lugares em aço inoxidável millipore equipado com colunas de filtro de microanálise de 25 milímetros com suportes de vidro e uma bomba mecânica é empregado usando técnica asséptica.

Coloque um único filtro de 25 milímetros na base da coluna do filtro. Aplique a coluna e prenda o aparelho juntos. Carregue 15 mililitros de amostra aqui obtida de um microcosmo de alto nutriente na coluna.

Abra a válvula de bloqueio no coletor do filtro e ligue o filtro da bomba sob leve pressão para minimizar a quebra da célula. Para amostras de densidade mais baixa, podem ser necessárias adições sucessivas de água. Tomando cuidado para não deixar o filtro secar por um longo período de tempo entre as adições de água.

Dois, reduzir os sais paramagnéticos residuais de amostras marinhas e o enxágue opcional com água doce pode ser realizado. Quando a filtragem terminar, desligue a bomba e deixe a válvula aberta para que ainda haja pressão negativa sob o filtro. Remova o clamp e a coluna do filtro com uma mão.

Use uma pinça limpa para segurar o filtro. Dobre o filtro sobre si mesmo, mas não vingue com a outra mão. Use a borda de um tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros para segurar o filtro.

Coloque o filtro no tubo de dois mililitros e solte-o para que ele abra com o sample lado voltado para dentro. Congele em nitrogênio líquido imediatamente para extrair os metabólitos solúveis aquosos. Primeiro lifealize as amostras durante a noite ou por pelo menos 10 horas após a liofilização, adicione um triturador de aço inoxidável a cada tubo fino.

Adicione 750 microlitros de tampão fosfato de potássio padronizado e óxido de deutério com o padrão DSS. Sonicar as amostras durante cinco minutos a quatro graus num sónico de água para remover o material celular do filtro. Remova os filtros com uma pinça limpa.

Interrompa as células usando um triturador a 1600 RPM por cinco minutos. Em seguida, incube a 65 graus Celsius. Estava tremendo em um shaker de bancada por 15 minutos.

Após a incubação, remova o triturador de metal com uma pinça limpa. Centrifugar a amostra a 13 000 g durante cinco minutos. Após centrifugação, retire o SUP natin e transfira diretamente para um tubo de RMN para espectroscopia NM r.

Carregue a amostra no espectrômetro de RMN aqui. As amostras são executadas em um espectrômetro Bruker DRX 500 equipado com sonda TXI com gradiente de eixo triplo operando a 298 Kelvin. Bloqueie, ajuste e calce o ímã.

Obtenha espectros de RMN de prótons 1D usando a interface de rotação superior e os métodos descritos anteriormente ou utilize outro software de interface do espectrômetro conforme necessário. Aqui, os espectros foram adquiridos com supressão de sinais de água residual pela sequência de pulso de Watergate com um tempo de repetição de 1,2 segundos. No presente exemplo, 128 transientes foram coletados para cada amostra.

Transfira os diretórios de dados NMR para um computador pessoal com o software de pipe NMR instalado. Processe os dados brutos, defina o sinal DSS como referência de PPM zero e, em seguida, faseie manualmente os espectros. Digitalize os dados espectrais por compartimento aqui usando o pacote FT two B disponível publicamente no site de comércio eletrônico.

Outros utilitários de software, como RNMR ou Atomics, também podem ser usados para bin. Escaninho. Os dados podem ser normalizados para sinal total ou DSS para mostrar mudanças proporcionais de sinal entre amostras. Os dados de saída agora podem ser usados para análise estatística downstream, como análise de componentes principais ou PCA usando pacotes de software livre como o R mostrado.

Aqui está um exemplo de espectros de RMN de prótons obtidos usando o procedimento demonstrado. Os espectros são de dois pontos de tempo de um experimento de microcosmo e mostram diferenças claras devido às atividades metabólicas das algas. O espectro do dia quatro mostra uma abundância considerável de picos, particularmente na faixa das três às 16:00 em comparação com a amostra do primeiro dia.

Esses picos podem ser atribuídos a açúcares produzidos por diatomáceas em flor dentro do microcosmo. Em um experimento semelhante, um gráfico de pontuação PCA derivado da curva em Mr.Spectra mostrando os dois primeiros componentes principais foi usado para comparar o crescimento de comunidades de plâncton natural em água do mar artificial e natural. Essa abordagem estatística reduz os dados multidimensionais em um formato mais simples aqui, bidimensional e simplesmente revela a estrutura nos pontos de dados subjacentes.

Cada um ou ambos os eixos são mais semelhantes aqui. Diferenças metabólicas claras entre os dois tratamentos podem ser vistas. Os dados deste experimento foram usados para realizar análises multiômicas.

A combinação de RMN com dados genômicos da composição da comunidade com base na eletroforese em gel de gradiente desnaturante dos genes 18 s e 16 S-R-R-N-A também mostra padrões distintos de comunidade microbiana entre microcosmos naturais e artificiais da água do mar. Essa correspondência entre metaboloma e genoma de sistemas naturais demonstra a utilidade dessa abordagem. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar uma técnica de assunto para minimizar a contaminação Após este procedimento.

Outros métodos, como análise de criação com níveis ômicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como o microbioma se correlaciona com certos metabólitos.