Entrega de genes subpiais na medula espinhal de camundongos para avaliar a expressão gênica

Pegue um camundongo anestesiado, raspe suas costas e desinfete a pele.

Incisar a pele, separar os músculos das vértebras e retrair-os usando grampos.

Perfure as lâminas vertebrais para criar rachaduras e, em seguida, remova os fragmentos ósseos para expor a dura-máter, a membrana externa da medula espinhal.

Usando uma agulha, crie uma abertura dural e perfure a pia-máter subjacente para entrar no espaço subpial para acesso direto ao tecido espinhal.

Pegue uma agulha de entrega contendo uma suspensão de vírus adeno-associado recombinante carregando um gene que expressa proteínas fluorescentes e injete a suspensão.

Retire a agulha, suture os músculos e a pele e permita que o camundongo se recupere.

O vírus se liga a receptores em neurônios e células gliais e é endocitado.

Uma vez dentro do núcleo, o vírus desencadeia a expressão gênica para produzir proteínas fluorescentes.

O modelo de entrega de genes subpiais está agora pronto para avaliar a expressão do gene alvo na medula espinhal.

Comece anestesiando adequadamente o animal para a cirurgia. O isoflurano é usado aqui. Certifique-se da ausência de uma resposta de beliscão da pata antes de prosseguir. Em seguida, cubra os olhos com pomada oftálmica. Em seguida, raspe as costas do animal com uma tesoura e limpe a pele com clorexidina a 2%.

Se forem realizadas injeções subpiais lombares, corte a pele que cobre as vértebras T8 a L1 com um bisturi. Em seguida, use uma tesoura para separar o músculo paravertebral das vértebras da coluna vertebral T10 a T12. Monte o animal em uma estrutura estereotáxica padrão usando grampos espinhais de camundongo. Em seguida, use uma broca dentária para raspar ambos os lados da lâmina das vértebras T10 a T12 até que apareçam rachaduras.

Em seguida, use uma pinça para remover fragmentos ósseos trincados e expor a superfície dorsal da medula espinhal lombar. A dura-máter agora é visível. Use uma agulha de aço inoxidável calibre 30 para fazer uma incisão de 1 a 2 milímetros na dura-máter.

É importante cortar cuidadosamente a dura-máter para evitar lesões na membrana pia subjacente.

Agora, segure a borda da dura-máter cortada com uma pinça e estenda a abertura da dura-máter por até 5 milímetros. Monte a agulha penetrante pia de calibre 34 e a agulha de injeção de calibre 36 nos braços Z de dois manipuladores XYZ separados usando suportes capilares de vidro.

Em seguida, use uma microseringa de 50 microlitros conectada com tubo PE-10 ou PE-20 para carregar o vírus AAV9-UBI-GFP. Depois que o vírus for carregado, conecte a extremidade do tubo à agulha de injeção. Em seguida, enquanto olha através de um escopo de dissecação cirúrgica ajustado para ampliação de 8 a 10x, use o braço X para abaixar a agulha de penetração pia na pia a uma profundidade de 1 milímetro. Mantenha o ângulo da agulha penetrante em 5 a 10 graus, em relação à superfície do tecido.

Depois de abrir a pia, use o braço X para remover a agulha penetrante da pia do espaço subpial. Observe o local penetrado usando um ponto de referência, como um vaso sanguíneo. Mova os braços X, Y e Z do segundo manipulador para posicionar a ponta da agulha de injeção carregada com vírus AAV9 no local penetrado pela pia.

Em seguida, depois de inserir a ponta da agulha de injeção cerca de 0,5 milímetros no espaço subpial, use o braço Z para levantar a pia cerca de 0,3 milímetros e, em seguida, use o braço X para continuar avançando a agulha horizontalmente no espaço subpial. Avance a agulha até que ela entre no espaço subpial a uma profundidade de cerca de 2 a 3 milímetros.

Em seguida, use a microseringa de 50 microlitros para injetar o vírus AAV9-UBI-GFP no espaço subpial. Remova a agulha de injeção do espaço subpial após a conclusão da injeção de AAV9-UBI-GFP. Feche o músculo e a pele usando sutura de monofilamento de flúor e clipes cirúrgicos. Deixe o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento antes de alojá-lo em uma gaiola limpa.