A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise de metilação do DNA em dinucleotídeos CPG por meio do sequenciamento genômico de DNA convertido por sulfito. Isso é realizado primeiramente desnaturando o DNA de dupla fita, para que a reação de conversão por bisulfito possa ocorrer. O segundo passo consiste na conversão de todas as citosinas não metiladas no DNA genômico em uracila por desaminação com bisulfito.

Esta reação envolve três fases. A primeira é a sulfatação do resíduo de citosina pela adição de bisulfito à ligação dupla entre os carbonos cinco e seis. Em segundo lugar, a desaminação hidrolítica da citosina pelo derivado de bisulfito produz um SSL pelo derivado de bisulfito, e em terceiro lugar, a remoção do grupo sulfonato por tratamento alcalino resulta em um resíduo de SSL.

Em seguida, a região-alvo é amplificada por meio de primers específicos para conversão com bisulfito e amplificação por PCR. O passo final consiste na clonagem e sequenciamento do produto de PCR, fornecendo resolução de nucleotídeo único para a metilação ao longo da molécula de DNA. Em última análise, os resultados demonstram a metilação do DNA em dinucleotídeos CpG no DNA genômico, explorando a maior sensibilidade da citosina em relação à 5-metilcitosina à desaminação por bisulfito em condições ácidas.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de sangue southern, é que ela pode permitir resolução de um único nucleotídeo na metilação de DNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de epigenética, como o papel da metilação do DNA em doenças humanas como o câncer. Para preparar amostras de DNA para conversão com bisulfito, incube primeiro dois microgramas de DNA genômico com bisulfito, tampão de lise de DNA e um volume total de 18 microlitros durante uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, desnature o DNA genômico adicionando dois microlitros de hidróxido de sódio recém-preparado a três molar, obtendo uma concentração final de 0,3 molar. Incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos em banho-maria, seguido de incubação a 90 graus Celsius por dois minutos. Em um bloco térmico, coloque imediatamente os tubos em gelo por cinco minutos, centrifugue os tubos por 10 segundos a 10.000 Gs para garantir que o DNA esteja no fundo do tubo; as amostras de DNA desnaturado estão agora prontas para a desaminação em células B, que será demonstrada a seguir.

Antes das reações de sulfatação e desaminação hidrolítica, prepare soluções frescas de quinol 10 milimolar e sulfito de sódio metabisulfito saturado em pH 5,0. Como o sulfito de sódio metabisulfito é uma solução saturada, pequenos grumos podem permanecer não dissolvidos. Adicione 208 microlitros do sulfito de sódio metabisulfito e 12 microlitros de quinol ao DNA desnaturado de 20 microlitros, em um volume final de 240 microlitros.

Vortexe os tubos e centrifugue por 10 segundos para garantir que todas as gotas estejam na parte inferior do tubo. Cubra as amostras com óleo mineral. Incube as amostras a 55 graus Celsius em banho-maria por quatro a 16 horas, dependendo da quantidade e qualidade do DNA a ser convertido.

É importante que a conversão com bisulfito ocorra no escuro para evitar oxidação. Ao final do tempo apropriado de incubação, centrifugue brevemente os tubos em uma microcentrífuga para garantir que todo o líquido esteja na parte inferior do tubo. Em seguida, pipete cuidadosamente a solução de DNA a partir da parte inferior do tubo, sem aspirar nenhum óleo mineral.

Para as próximas etapas, nosso laboratório utiliza o sistema Promega Wizard de purificação de DNA. Adicione um mililitro de resina às amostras de DNA, inverta o tubo para misturar e, em seguida, aspire a solução com uma pipeta e transfira para uma seringa acoplada a uma coluna de dessalinização. Por fim, para remover quaisquer íons bisulfito livres, passe o DNA tratado com bisulfito pela coluna de dessalinização e elua em 50 microlitros de água Milli-Q.

O próximo passo é remover o grupo bisulfito do anel de uracila por desaminação. Para isso, adicione 5,5 microlitros de hidróxido de sódio recém-preparado a 3 molar a cada amostra de DNA tratada com bisulfito, obtendo uma concentração final de 0,3 molar. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Centrifugue brevemente as amostras e, em seguida, adicione um microlitro de TRNA a cada amostra. Neutralize a solução adicionando acetato de amônio até uma concentração final de três molar. Em seguida, precipite o DNA com etanol.

Adicione 330 microlitros de etanol a 100%, gelado, e misture bem por inversão. Incube a menos 20 graus Celsius por uma hora até a noite toda, seguido de centrifugação a 14.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova completamente o sobrenadante e seque o DNA precipitado ao ar por aproximadamente 20 minutos.

Após a secagem ao ar, o pellet é quase impossível de ver; ressuspenda o pellet de DNA em 50 microlitros de TE 0,1X ou água e deixe em temperatura ambiente por aproximadamente duas horas. Durante esse período, vorteixe os tubos ocasionalmente para garantir a dissolução do DNA, seguido por uma rápida centrifugação. Uma vez que o DNA estiver dissolvido, ele pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius por um a 10 anos, dependendo da quantidade e qualidade do DNA, ou pode ser usado imediatamente. Para amplificação por PCR, a otimização dos iniciadores é o aspecto mais difícil deste procedimento.

Portanto, as seguintes orientações são fornecidas para ajudar a garantir o sucesso no design de primers. Para ilustrar essas orientações, a sequência-alvo foi convertida por sulfito, de modo que, quando escrita, as citosinas convertidas aparecem como Ts azuis e os sítios CPG não convertidos aparecem como cgs vermelhos. Os primers devem ter entre 24 e 30 pares de bases de comprimento para garantir especificidade. Os primers devem apresentar uma temperatura de melting (TM) prevista semelhante, acima de 50 graus Celsius, e não devem diferir em mais de um a dois graus Celsius.

Os iniciadores devem conter múltiplas bases de C a T, aproximadamente 25%, para garantir a especificidade da conversão. A base final na extremidade três prima deve ser uma C a T para assegurar a amplificação de dinucleotídeos D-N-A-C-P-G convertidos. Os sítios C-P-G devem ser evitados na sequência do iniciador para evitar viés potencial em relação a modelos metilados, não metilados ou não convertidos. No entanto, se for inevitável, a citosina no sítio C-P-G deve ser substituída por um Y para ajudar a garantir uma amplificação imparcial do DNA convertido.

Por fim, projete conjuntos de iniciadores aninhados ou semi-aninhados para garantir a especificidade ou sensibilidade da reação de PCR, se necessário. Prepare misturas de reação para amplificação por PCR em alíquotas de 25 microlitros para otimização. Cada reação contém DNA genômico convertido por sulfito, iniciadores DPS, cloreto de magnésio, cloreto de potássio, tris cloreto de hidrogênio pH 8,3 e anac polimerase para testar o viés de amplificação de material metilado ou não metilado.

Utilize uma amostra controle 50% metilada e 50% não metilada, totalmente convertida por bisulfito, para testar a amplificação proporcional pela PCR com conversão por bisulfito. Use primers específicos e mistura de reação de PCR em um termociclador com gradiente de temperatura; configure a reação no gradiente, mais ou menos três graus Celsius a partir da TM do primer, em oito a 10 tubos. Vortexe os tubos e centrifugue brevemente em um microcentrífuga antes de colocá-los no termociclador. Esta figura mostra um gel de agarose com um perfil de amplificação PCR em gradiente de temperatura a partir de uma mistura de DNA 50% metilado e não metilado.

Os amplicons de PCR e as linhas marcadas com T, linhas dois, cinco e oito, foram tratados com uma enzima de restrição que digere apenas DNA metilado; as condições ideais de amplificação por PCR devem amplificar amplicons metilados e não metilados em proporção e sem viés, resultando em uma quantidade igual de produto de PCR cortado e não cortado, como observado aqui. As condições ideais de termociclagem para amplificação não enviesada são de 55,6 graus Celsius. A conversão completa do DNA de bisulfito pode ser analisada por digestão com uma enzima específica para sítios de citosina, que digerirá apenas o DNA não convertido, linhas três, seis e nove.

A conversão completa de DNA com bissulfito é indicada aqui pela ausência de DNA cortado em todas as três faixas, faixas três, seis e nove. Este gráfico de dissociação em tempo real mostra uma proporção igual de DNA metilado e não metilado, linha vermelho-laranja, mistura 50 50, em comparação com a amplificação controle de DNA totalmente metilado, linha rosa M, e não metilado, linha verde U, que se dissociam a 82,9 graus Celsius e 86,9 graus Celsius, respectivamente. Isso indica que não há viés de amplificação com base na temperatura na qual as diferentes moléculas se dissociam.

Os fragmentos de PCR resultantes da amplificação de amostras tratadas com bisulfito podem ser visualizados por eletroforese em gel de agarose e sequenciados. É mostrado diretamente aqui um rastro de sequência de três linhagens celulares diferentes, com os sítios CPG destacados em amarelo; a linhagem celular X exibe 100% de metilação nos três sítios CPG, enquanto as linhagens celulares Y e Z mostram graus variáveis de metilação, conforme observado pelos sinais sobrepostos de GA exibidos aqui. A Figura quatro A é um rastro de sequência de três linhagens celulares diferentes, com os sítios CPG destacados em amarelo.

Após o sequenciamento direto de clones individuais, o estado de metilação das moléculas individuais pode ser tabulado em um mapa de bisulfito. Para visualizar a metilação heterogênea, a densidade de metilação em sítios CpG individuais é mostrada em vermelho. Neste mapa de bisulfito representativo, análise quantitativa de alto rendimento da metilação de uma amostra.

Utilizando a tecnologia Sequenom Epi Typer, é possível gerar um espectro específico dependente da presença de citosinas metiladas, como mostrado no exemplo da Figura cinco A. Um resumo das proporções na amostra pode então ser extrapolado na forma de um epígrafe, Figura cinco B. Este exemplo mostra a porcentagem de metilação de DNA em cada sítio CpG para quatro linhagens celulares diferentes. Finalmente, um resumo em forma de gráfico de metilação, Figura cinco C, pode ser derivado do epígrafe após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de epigenética explorarem a metilação do DNA e seu papel nas doenças humanas.