A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise da metilação do DNA de dinucleotídeos CPG por sequenciamento genômico de DNA convertido por sulfito. Isso é feito primeiro desnaturando o DNA de fita dupla, para que a reação de conversão do bissulfito possa ocorrer. O segundo passo é converter todas as citosinas não metiladas no DNA genômico em uracila por desaminação de bissulfito.

Esta reação envolve três fases. A primeira é a sulfatação do resíduo de citosina pela adição de sulfito B às cinco seis ligações duplas. Em segundo lugar, a desaminação hidráulica da citosina por derivado de sulfito produz um SSL por derivado de sulfito e, em terceiro lugar, a remoção do grupo sulfonato por tratamento alcalino resulta em um resíduo SSL.

Em seguida, a região alvo é amplificada por primers específicos de conversão de bissulfito e amplificação por PCR. A etapa final é a clonagem e o sequenciamento do produto de PCR para fornecer resolução de nucleotídeo único para metilação através da molécula de DNA. Em última análise, os resultados mostram a metilação do DNA dos dinucleotídeos CPG no DNA genômico através da exploração do aumento da sensibilidade da citocina versus cinco metil citosina à desaminação do bi-sulfato sob condições ácidas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a análise de sangue do sul, é que ela pode permitir a resolução de um único nucleotídeo de metilação d. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como o papel da metilação do DNA em doenças humanas como o câncer. Para preparar amostras de DNA para conversão de bissulfito, primeiro incube dois microgramas de DNA genômico com bissulfito, tampão de lise de DNA e um volume total de 18 microlitros por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, desnature o DNA genômico adicionando dois microlitros de hidróxido de sódio de três molares recém-preparados a uma concentração final de 0,3 molar. Incubar as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos em banho-maria, seguido de incubação a 90 graus Celsius por dois minutos. Em um bloco de calor, coloque imediatamente os tubos no gelo por cinco minutos, centrifugue os tubos por 10 segundos a 10.000 Gs para garantir que o DNA esteja no fundo do tubo, as amostras de DNA desnaturadas estão agora prontas para a desaminação de combate às células B, que será demonstrada a seguir.

Antes das reações de sulfatação e desaminação hidrolítica, preparar soluções frescas de quinol 10 milimolar e meta de sódio saturado com sulfito pH 5,0. Como o meta-sódio por sulfito é uma solução saturada, pequenos caroços podem permanecer não dissolvidos. Adicione o meta de sódio por sulfito 208 microlitros e quinol 12 microlitros ao DNA desnaturante 20 microlitros em um volume final de 240 microlitros.

Vortex os tubos e centrifugue por 10 segundos para garantir que todas as gotículas estejam no fundo do tubo. Cubra as amostras com óleo mineral. Incubar as amostras a 55 graus Celsius em banho-maria por quatro a 16 horas, dependendo da quantidade e qualidade do DNA a ser convertido.

É importante que a conversão do bissulfito ocorra no escuro para evitar a oxidação. No final do tempo de incubação apropriado, gire os tubos brevemente em uma microcentrífuga para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo. Em seguida, pipete cuidadosamente a solução de DNA do fundo do tubo sem absorver nenhum óleo mineral.

Para as próximas etapas, nosso laboratório usa o sistema de limpeza de DNA do assistente promega. Adicione um mililitro de resina às amostras de DNA, inverta o tubo para misturar e, em seguida, pipete a solução para uma seringa conectada a uma coluna de dessalinização. Finalmente, para remover quaisquer íons bissulfito livres, passe o DNA tratado com bi sulfito pela coluna de dessalinização e aluda a 50 microlitros de água Milli Q.

O próximo passo é remover o sótão de bissulfito do anel de uracila por dessalinização. Para conseguir isso, adicione 5,5 microlitros de hidróxido de sódio de três molares recém-preparados a cada amostra de DNA tratada com bissulfito para uma concentração final de 0,3 molar. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Centrifugue as amostras brevemente e, em seguida, adicione um microlitro de TRNA a cada amostra. Neutralizar a solução adicionando acetato de amónio a uma concentração final de três molares. Em seguida, o etanol precipita o DNA.

Adicione gelado, 100% etanol 330 microlitros e misture bem por inversão. Deixe a menos 20 graus Celsius por uma hora para centrifugar durante a noite a 14.000 GS por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remover todos os vestígios de sobrenadante e secar ao ar o ADN precipitado durante cerca de 20 minutos.

Após a secagem ao ar, o pellet é quase impossível de ver ressuspender o pellet de DNA em 50 microlitros de 0,1 XTE ou água sair em temperatura ambiente por aproximadamente duas horas durante esse tempo, ocasionalmente, vórtice os tubos para garantir que o DNA seja dissolvido, seguido por uma centrífuga rápida. Uma vez que o DNA é dissolvido, ele pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius por um a 10 anos, dependendo da quantidade e qualidade do DNA, ou ser usado imediatamente. Para amplificação por PCR, a otimização do primer é o aspecto mais difícil deste procedimento.

Portanto, as diretrizes a seguir são fornecidas para ajudar a garantir o sucesso do design do primer. Para ilustrar essas diretrizes, a sequência alvo foi convertida por sulfito de modo que, quando escritas, as citosinas convertidas aparecem como Ts azuis e os locais CPG não convertidos aparecem como primers cgs vermelhos devem ter 24 a 30 pares de bases de comprimento para garantir a especificidade. Os primers devem ter uma MT prevista de forma semelhante acima de 50 graus Celsius e não diferir em mais de um a dois graus Celsius.

Os primers devem conter várias bases de aproximadamente 25% C a T para garantir a especificidade da conversão. A base final de que as três extremidades primárias devem ser um C a T para garantir a amplificação dos dinucleotídeos D-N-A-C-P-G convertidos deve ser evitada na sequência do primer para evitar viés potencial para modelos metilados, não metilados ou não convertidos. No entanto, se inevitável, a citosina no local do CPG deve ser substituída por um Y para ajudar a garantir a amplificação imparcial do DNA convertido.

Finalmente, projete conjuntos de primers aninhados ou semi-aninhados para garantir a especificidade ou sensibilidade da reação de PCR, se necessário. Prepare misturas de reação de amplificação de PCR em alíquotas de 25 microlitros para otimização. Cada reação contém primers DPS de DNA genômico convertido em sulfito, cloreto de magnésio, cloridrato de potássio tris hydrochloride pH 8,3 anac polimerase para testar o viés de amplificação de material metilado ou não metilado.

Use uma amostra de controle 50 50 metilada não metilada totalmente convertida em bissulfito para testar a amplificação proporcional de PCR com conversão de bissulfito. Primers específicos e mistura de reação de PCR em um termociclador de gradiente de temperatura definem a reação de execução em um gradiente de mais ou menos três graus Celsius a partir do TM do primer em oito a 10 tubos, vórtice os tubos e giram brevemente em uma microcentrífuga antes de colocá-los no termociclador. Esta figura mostra um gel agros com um perfil de amplificação de PCR de gradiente de temperatura a partir de uma mistura de DNA 50% metilado e não metilado.

Os amplificadores de PCR e as pistas marcadas com as faixas T dois, cinco e oito foram tratados com uma enzima de restrição que digere apenas DNA metilado, as condições ideais de amplificação de PCR devem amplificar amplicons metilados e não metilados na proporção e sem viés, resultando em uma quantidade igual de produto de PCR cortado e não cortado, como visto aqui. As condições ideais de termociclagem para amplificação não polarizada são de 55,6 graus Celsius. A conversão completa do DNA do bissulfito pode ser analisada por digestão com uma enzima específica do local da citosina que digere apenas as pistas de DNA não convertidas três, seis e nove.

A conversão completa do DNA do bissulfito é indicada aqui pela ausência de DNA cortado em todas as três pistas, pistas três, seis e nove. Este gráfico de dissociação em tempo real mostra uma proporção igual de mistura de DNA vermelho laranja da linha 50 50 metilado e não metilado em comparação com a amplificação de controle da linha rosa m totalmente metilada e da linha verde de DNA U não metilada, que se dissociam a 82,9 graus Celsius e 86,9 graus Celsius, respectivamente. Isso indica que não há viés de amplificação com base na temperatura na qual as diferentes moléculas se dissociarão.

Os fragmentos de PCR resultantes da amplificação de amostras tratadas com bi sulfito podem ser visualizados por eletroforese em gel agros e sequenciados. Diretamente mostrado aqui está um traço de sequência de três linhas celulares diferentes com locais CPG destacados em amarelo linha celular X exibe 100% de metilação em todos os três locais CPG, onde as linhas celulares Y e Z mostram vários graus de metilação, conforme visto pela sobreposição de sinais GA mostrados aqui. A Figura quatro A é um traço de sequência de três linhagens celulares diferentes com locais de CPG destacados em amarelo.

Após o sequenciamento direto de clones individuais, o estado de metilação das moléculas individuais pode ser tabulado em um mapa de bissulfito. Para visualizar a metilação da heterogeneidade, a densidade de metilação em locais individuais de CPG é mostrada em vermelho. Neste mapa representativo de bissulfito, análise quantitativa de metilação de alto rendimento de uma amostra.

O uso da tecnologia de epitipador de sequenoma pode produzir um espectro específico dependente da presença de citosinas metiladas, como mostrado neste exemplo Figura cinco A.Um resumo das proporções na amostra pode então ser extrapolado na forma de um epigrama figura cinco B.Este exemplo mostra a porcentagem de metilação do DNA em cada local CPG para quatro linhagens celulares diferentes. Finalmente, um resumo do gráfico de metilação figura cinco C pode ser derivado do epigrama Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da epigenética explorarem a metilação do DNA e seu papel em doenças humanas.