Name: A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Aprenda análise de metilação do DNA com resolução de nucleotídeo único usando conversão de bissulfito e sequenciamento genômico. Este método avançado permite distinguir citosinas metiladas e não metiladas em pesquisas de epigenética e câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bissulfito de conversão de protocolo Um protocolo padrão para a conversão de 2 microgramas de DNA genômico é descrito abaixo. Quantidades maiores ou menores do DNA genômico (100 pg-200 mg) também pode ser tratada com sucesso bissulfito. Estas condições de reação resultar em conversão completa (99,5-99,7%) de quase todas as seqüências de DNA alvo 3. 1. Preparação DNA Preparação de amostras, incubando DNA genômico com tampão de bissulfito de DNA de Lise (2 mg t RNA, 280 ng / mL de Proteinase K, SDS 1%) em um volume total de 18 mL para 1 hr a 37 ° C. Nota: Isto é importante para alcançar conversão de bissulfito máxima, especialmente com DNA isolado de amostras clínicas, onde ainda pode haver proteína associada com o DNA. 2. DNA Desnaturação <ol><li> Desnaturar DNA mg 2 em um volume de 20 l, adicionando 2 l da recém-preparados 3M NaOH para um final de cONCENTRAÇÃO de 0.3M. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C por 15 min em banho-maria, seguido de incubação a 90 ° C por 2 min em um bloco de calor. Colocar imediatamente os tubos em gelo durante 5 min. </li><li> Centrifugar os tubos a 4 ° C por 10 s em 10.000 g, para garantir o DNA está no fundo do tubo. </li></ol> 3. Desaminação bissulfito Sulfonação e desaminação hidrolítica <ol><li> Preparar soluções fresco de 10 mM quinol e saturado de sódio metabissulfito de pH 5,0 (7,6 g Na 2 S 2 O 5 com 464 mL de NaOH 10 M, feita até 15 ml com água). A solução de bissulfito de sódio saturada é obtida invertendo suavemente o reagente / H mistura O 2, com mínimo de mistura e aeração. Se necessário, ajustar o pH com NaOH 10 M, para a dissolução total da Nota de metabissulfito de:. Como é uma solução saturada, pequenos caroços ainda pode permanecer não dissolvida. </li><li> Adicionar 208mL do metabissulfito de saturada e 12 mL de quinol 10mM para o DNA desnaturado (20 l), em um volume final de 240 mL para uma concentração final de 2.31M bisulphite/0.5mM quinol, pH 5.0. Misture suavemente todos os reagentes e centrifugar por 10 segundos para garantir a todos as gotas são na parte inferior do tubo. </li><li> Sobreposição das amostras, com 200 mL de óleo mineral. Incubar as amostras a 55 ° C em banho-maria, por 4-16 horas. A duração do tratamento bissulfito é dependente da quantidade e qualidade do DNA a ser convertido. Para o DNA de má qualidade ou DNA degradado, limitar o tempo de incubação a 4 horas. Nota: é importante que que a conversão de bissulfito ocorre no escuro para evitar a oxidação, por isso, se isso não é possível envolver os tubos em alumínio antes da incubação . </li><li> No final do tempo de incubação apropriado, spin os tubos brevemente em uma microcentrífuga para garantir todo o líquido está no fundo do tubo. </li><li> Recuperar o DNA de bissulfito de tratadosdebaixo da camada de óleo com cuidado pipetagem fora da solução de DNA a partir do fundo do tubo, sem ocupar qualquer um dos óleos minerais. </li></ol> Dessalinização <ol start="5"><li> Remova todos os íons livres de bissulfito passando por uma coluna de dessalinização e eluição em 50 ul de água milli-Q (MQH 2 O). Dependendo da quantidade e qualidade do DNA genômico e como ele é preparado, diferentes colunas dessalinização pode ser usado. Nós usam rotineiramente Promega Assistente Clean up colunas, como estas colunas são adequados para remover o SDS utilizados na preparação do DNA antes da conversão. </li></ol> Desulphonation alcalinos <ol start="6"><li> O aduto de bissulfito é removido do anel de uracil por desulphonation. Desulphonate adicionando 5,5 mL de NaOH 3M preparada para uma concentração final de 0.3M, em seguida, incubar as amostras a 37 ° C por 15 min. </li><li> Centrifugar brevemente e adicione 1 ml de RNA t (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; Neutralize a solução com a adição de 33 mL de acetato de amónio (NH 4 O Ac), pH 7,0 para uma concentração final da 3M. <li> Etanol precipitar-DNA, adicionando a 330 mL de etanol 100% gelado, misture bem por inversão. Deixe-a 20μC para 1 hr durante a noite. Centrifugar a 14.000 g por 15 min a 4 ° C. Remover todos os vestígios do sobrenadante e ar seco o DNA precipitado para ~ 20 min. </li><li> Re-suspender o pellet de DNA em 50 ul / g de 0,1 TE (10 mM Tris-HCL, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ou H 2 O. Deixe em temperatura ambiente por cerca de 2 horas. Ocasionalmente vortex os tubos para assegurar o DNA é dissolvido, seguido por uma centrifugação rápida. </li><li> Use imediatamente para a amplificação, ou armazenar a -20 ° C para 10-10 anos, dependendo da quantidade e qualidade do DNA. </li></ol> 4. Amplificação PCR Design de Primer <ol><li> Projeto eficaz de PCR bissulfito de conversão de primers específicos é crucial para assegurar que a amplificação, eficiente imparciais sobre DNA completamente convertido ocorre. As diretrizes a seguir são usados ​​para ajudar desenho de primers. </li></ol> Diretrizes de design Primer <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg"> Thermocyling <ol start="2"><li> Para testar a amplificação pela PCR proporcional de DNA metilado e não metilado, use um 50:50 metilados / unmethylated amostra de controlo totalmente convertido bissulfito e amplificar com o bissulfito de conversão de primers específicos sob o otimizado condições de reação de PCR (Figura 3). Para o metilados 50:50: controle não metilado, use in vitro DNA metilado SSSI e quer todo o genoma DNA amplificado (WGA) ou DNA de sangue total. Por favor, esteja ciente de que alguns genes metilados será naturalmente no sangue e, portanto, nesses casos o melhor é usar apenas WGA DNA como o controle "não metilado". </li><li> Prepare misturas de reacção PCR em 100 &amp; mu; alíquotas l contendo 2 l de DNA genômico convertido bissulfito, 200 mM dNTP, 1 primers mM, 1,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 e 0,15 mL da polimerase Taq. </li><li> Em um termociclador gradiente de temperatura, defina a reação executado em um gradiente de + / - 3 ° C a partir do Tm previsto do primer em 10 tubos </li></ol><img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"><ol start="5"><li> Para testar se a metilado e não metilado amplicons foram amplificados em proporção, o amplicon pode ser digerido com uma enzima de restrição informativa, como Taq 1 (TCGA), que digerem o DNA metilado, mas não vai digerir DNA não metilado quando o site enzima de restrição é alteradas após a conversão de bissulfito de TTGA. A extensão da digestão pode ser visualizado por eletroforese em gel de agarose (Figura 3A). Alternativamente, SYBRGreen (0,2 mL de diluição de 1:1000) podem ser adicionados à reação de PCR eo grau de metilação podem ser avaliados através da realização de parcelas de calor em uma dissociação real-time PCR termociclador (Figura 3B). </li><li> PCR Reaction mix incluindo MgCl 2 condições de concentração e termociclagem pode precisar de ser ajustado para aumentar a eficiência PCR ou para assegurar a ampliação proporcional da PCR metilado e não metilado fragmentos PCR. </li><li> Uma vez que as condições são otimizadas PCR, amplificação por PCR pode ser realizada em amostras de bissulfito de convertidos. Nota: Uma vez que o Tm é otimizado uma temperatura gradiente PCR não precisa ser usado. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de otimização de bissulfito de amplificação por PCR é mostrado na Figura 3. Condições de amplificação ideal PCR deve amplificar metilado e não metilado amplicons, proporcionalmente e sem viés. Figura 3A mostra um gel de agarose com um perfil de temperatura de amplificação PCR gradiente de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado. Thamplicons e PCR têm sido tratados com uma enzima de restrição, Taq 1 (TCGA), que irá digerir metilado (M) DNA, mas não vai digerir unmethylated (U) DNA como o local enzima de restrição é alterada pela conversão de bissulfito de TTGA. Uma quantidade igual de corte e produto de PCR uncut é esperado se o DNA metilado e não metilado é amplificado na mesma proporção. Ele pode ser visto nesta gel que as condições ótimas para thermocyling não-preconceito de amplificação está em 56,1 ° C (T). Conversão completa do DNA de bissulfito também podem ser analisados ​​por digestão com enzima citosina-site específico, como Hpa III (CCGG). Hpa III só vai digerir se a conversão falhou, como o sítio de restrição será mantida. Se a conversão for concluída o sítio de restrição serão convertidos para TCGG ou TTGG dependendo do estado de metilação do DNA. Conversão de DNA completa de bissulfito pode ser visto na Figura 3A (H). Figura 3B mostra um gráfico em tempo real que a dissociaçãotambém pode ser usado como uma ferramenta para determinar se existe qualquer viés de amplificação com base na temperatura em que as diferentes moléculas que se dissociam. Nesta figura pode-se ver que a PCR ampliou metilado (M) e não metilado de DNA (U), na proporção de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado em comparação com a amplificação de DNA de controle totalmente metilado e não metilado, que se dissociam em 82.1μC e 78.9μC respectivamente. Após a otimização das condições de reação thermocyling e bissulfito de amostras tratadas pode ser amplificada com vertente específica e bissulfito de primers específicos em qualquer uma reação de PCR simples ou semi nested. Os fragmentos resultantes PCR pode ser visualizado por eletroforese em gel de agarose e seqüenciados diretamente (Figura 4A) ou por clonagem e seqüenciamento. Depois de clonagem e sequenciamento do estado de metilação das moléculas individuais podem ser tabulados, em um mapa de bissulfito (Figura 4B), para visualizar a heterogeneidade dosmetilação. Alta taxa de análise de metilação quantitativa pode ser pré-formados usando a tecnologia como a utilizada pelo método EpiTYPER Sequenom. Usando este método, o DNA convertido bissulfito é amplificado com bissulfito PCR primers específicos e seguido por um processo de clivagem proprietry. Os fragmentos resultantes são quantificados por MALDI-TOF espectrometria de massa com o espectro específico depende da presença de citosinas metiladas (Figura 5A). Um resumo das razões de metilação na amostra pode ser extrapolado, na forma de um epigrama (Figura 5B) ou parcela de metilação (Figura 5C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática CpG metilado. Na célula normal, promotor associado ilhas CpG não metiladas são predominantemente (cinza), enquanto sites de CpG no gene corpos são escassos e geralmente metilado (vermelho). O painel da direita se expande a estrutura molecularure de DNA em um site individual CpG e mostra metilação com uma molécula de carbono CH3 em 5 de citosina. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. . Chemical esquema de conversão Análise de metilação do DNA inclui quatro fases principais, como mostrado; desnaturação, a conversão de bissulfito, amplificação e análise. No painel direito, modificações na molécula de citosina que ocorrem durante a conversão de bissulfito são retratados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Otimização de PCR de amplificação. A. Eletroforese em gel de agarose com um perfil de temperatura de amplificação PCR gradiente de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado. Fragmentos foram digeridos com o Taq1 (T) ou HpaIII (H), que digerem o DNA metilado e DNA bissulfito não convertido, respectivamente. B. Calor análise da curva de dissociação mostra uma equal proporção de DNA metilado e não metilado (linha vermelha mix 50/50) em comparação com o controle de amplificação totalmente metilados (linha rosa, M) e DNA não metilado (linha verde, U), que se dissociam de 82,1 ° C e 78,9 ° C, respectivamente. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4a"> <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4b"> Figura 4. Exemplo de seqüenciamento direto e um mapa de bissulfito. A. Trace seqüência de três linhas de células diferentes com sítios CpG realçado em amarelo. Célula da linha X exibe metilação 100% em todos os três locais CpG enquanto célula linhas Y e Z mostram diferentes graus de metilação, como visto pela sobreposição G / A sinais. B. Representante bissulfito mapa que mostra a densidade de metilação (pontos vermelhos) em sites individuais CpG, conforme determinado pelo seqüenciamento direto de clones individuais. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5a"> Figura 5. Alta taxa de análise de metilação do DNA usando Sequenom. A. Vista espectro usando a tecnologia Sequenom epiTYPER. Fragmentos de DNA mostrar espectros específicos, dependendo da quantidade de presentes a metilação do DNA. B. Epigram resumo da porcentagem de metilação do DNA em cada local de CpG por quatro diferentes linhagens celulares. C. resumo do enredo de metilação derivado da Epigram Sequenom.

<ol><li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+genomic+sequencing%3A+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li>
<li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+bisulphite+modification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Análise de DNA por metilação do DNA sequenciamento genômico convertido bissulfito é um método bem estabelecido e versátil, que facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. No entanto, a conversão de bissulfito e posterior análise baseia-se na premissa de que o DNA foi totalmente convertido com cada citosina unmethylated sendo desaminada de uracil e só citosinas metiladas restantes un-reativa. Se a conversão é incompleta, podem surgir problemas com a análise já que não convertida citosinas não metiladas podem ser incorretamente interpretado como citosinas metiladas. Conversão de bissulfito pode ser otimizado em vários estágios para maximizar a percentagem de conversão. Para o DNA para ser totalmente convertida em primeiro lugar deve ser fita simples de modo que os resíduos de citosina estão expostos aos íons bissulfito. O primeiro passo, desnaturação do DNA, é crítico e pode ser a fonte de conversão incompleta se o DNA não é totalmente desnaturado. Para garantirque o DNA é totalmente desnaturado, é importante que os parâmetros de reação, incluindo a remoção de todas as proteínas associadas, concentração de sal adequada, a temperatura de incubação e tempo são adequados para manter o DNA na conformação de fita simples. É importante usar fresco 3M NaOH e para dar tempo de incubação adequada. Se o DNA está resistindo desnaturação, algumas modificações no protocolo incluindo o alargamento do tempo de incubação a 30 minutos ou a fragmentação do DNA antes da desnaturação pode facilitar a desnaturação do DNA. Além disso, DNA de fita simples (ssDNA) pode re-anneal dobrar DNA de fita (dsDNA) durante a reação de conversão de bissulfito. Realizar a reação a uma temperatura superior (90-95 ° C) ou periodicamente, ou de forma contínua durante a reação de bissulfito pode ajudar a manutenção de ssDNA. No entanto, é importante estar ciente de que a degradação do DNA é muito acelerado a estas temperaturas mais elevadas. Vários reagentes também pode ser adicionado para interromper re-annealing of thfitas de DNA e, como a uréia. A concentração de DNA e sua qualidade também pode afetar a eficiência da reação de bissulfito PCR e rendimento final. Degradação do DNA é uma limitação do protocolo de conversão de bissulfito. O tratamento químico do DNA introduz rupturas dos filamentos vários ssDNA e algumas das duras condições necessárias para a conversão de bissulfito completo, incluindo concentração de bissulfito de alta, os tempos de incubação longo podem acelerar a degradação do DNA. Nas condições de reação padrão descrito, a degradação do DNA não é um problema comum no entanto, se as modificações de protocolo são introduzidos, como por sequências que são refratários à conversão, para modelos de DNA que estão degradadas ou de baixa qualidade, tais como amostras de FFPE, em seguida, degradação do DNA pode se tornar uma limitação significativa. Formalina parafina, fixo incorporado (FFPE) e amostras de DNA degradado pode ser efetivamente bissulfito convertido e amplificado utilizando este protocolo, No entanto modificações para garantir que o DNA não é mais degradadas são aconselhados. O uso de uma RNA transportador, tais como t RNA é recomendado. Glicogênio também pode ser adicionado como um transportador quando a concentração de DNA é baixa (&lt;200 ng). Como o DNA isolado de tecidos FFPE já está fragmentado e fragmentação ocorre durante desaminação, os cuidados devem ser tomados para minimizar a degradação ainda mais. Não fragmento de DNA mais longe antes de desnaturação e limitar o tempo de incubação para a reação bissulfito a 4 horas. Design amplicons não maior do que 300 bp DNA devido a fragmentada. Outro fator que pode afetar a amplificação por PCR que a conversão de bissulfito de citosinas não metiladas reduz a complexidade do modelo de DNA. O protocolo do projeto a seguir cartilha descritos na seção 4.1, o comprimento aumentou primário e PCR aninhado podem ajudar a aumentar a especificidade e rendimento de PCR. Finalmente, uma vez que o modelo de DNA é alterada durante bisulphite de conversão, o viés de amplificação pode ser uma preocupação. Garantir que a amplificação PCR proporcional de modelos metilado e não metilado é verificada com um controle de mix 50/50 DNA M / U, conforme descrito no protocolo, veja a Figura 3. Também garantir que a amplificação de modelos apenas convertido está ocorrendo usando HpaIII enzima de restrição e eletroforese em gel (Figura 3). As condições de PCR podem precisar de ser otimizado através da variação da temperatura e concentração de / ou magnésio ou alongamento do tempo de extensão. Alguns modelos parecem ser particularmente problemática ea posição cartilha pode ter de ser ajustada ou iniciadores degenerados podem precisar de ser usado. Técnicas de sequenciamento de última geração estão evoluindo rapidamente para conseguir uma resolução semelhante à de bissulfito de sequenciamento genômico, ea terceira geração de seqüenciamento única molécula tem potencial para permitir a análise de DNA de ambos primários e metilação sem a necessidade de seqüenciamento de bissulfito. No entanto, disponibilidade generalizada e especificaçõesificity destas técnicas permanecem algum tempo afastado. Sequenciamento genômico bissulfito é o padrão-ouro na análise de metilação e é um protocolo robusto. O método tem progredido ao ponto onde os problemas comuns e limitações foram resolvidas e as aplicações têm se expandido a partir de análises de genes individuais de alto rendimento e análise de genoma descrito por Clark et al. 2006 4. Diretrizes solução de problemas e recomendações adicionais estão descritos na Tabela 1. Sugere-se que a abordagem ideal é inicialmente seguir o protocolo padrão e apenas introduzir modificações se e quando surge um problema. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tabela 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 2"> Tabela 1. Diretrizes Troubleshooting

<ol><li> Metabissulfito de sódio (Ajax Finechem) </li><li> Hidroquinona (Merck) </li><li> Assistente do sistema DNA-clean-up (Promega) </li></ol>

a metilação do dna: modificação e análise de bissulfito

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenética descreve as mudanças hereditárias em função do gene, que ocorrem de forma independente para a seqüência de DNA. A base molecular da regulação do gene epigenético é complexa, mas essencialmente envolve modificações no próprio DNA ou as proteínas com as quais DNA associados. A modificação epigenética predominante de DNA em genomas de mamíferos é a metilação dos nucleotídeos citosina (5-MEC). Metilação do DNA fornece instruções para máquinas de expressão gênica de onde e quando o gene deve ser expresso. A seqüência alvo principal para a metilação do DNA em mamíferos é 5&#39;-CpG-3 &#39;dinucleotídeos (Figura 1). Dinucleotídeos CpG não são uniformemente distribuídos por todo o genoma, mas estão concentrados em regiões de seqüências genômicas repetitivos e CpG &quot;ilhas&quot; comumente associado com os promotores de gene (Figura 1). Padrões de metilação do DNA são estabelecidos no início do desenvolvimento, modulados durante a diferenciação de tecidos específicos e interrompida em muitos estados de doenças incluindo o câncer. Para understand o papel biológico de metilação do DNA e seu papel na doença humana, precisa, eficiente e reprodutível métodos são necessários para detectar e quantificar cada 5-MEC. Este protocolo para a conversão de bissulfito é o &quot;padrão ouro&quot; para a análise de metilação do DNA e facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. A química da desaminação de citosina por bissulfito de sódio envolve três etapas (Figura 2). (1) sulfonação: A adição de bissulfito à ligação 5-6 dobro de citosina Desaminação (2) hydrolic: desaminação hidrolítica do derivado resultante citosina-bissulfito de dar um derivado uracil bissulfito (3) Desulphonation Alkali: A remoção do sulfonato grupo por um tratamento alcalino, para dar uracil. Bissulfito preferencialmente deaminatos de citosina a uracil em DNA de fita simples, enquanto o 5-MEC, é refratária ao bissulfito mediada desaminação. Após a amplificação pela PCR, uracila é amplificadacomo timina enquanto 5-MEC resíduos permanecem como citosinas, permitindo CpGs metilado para ser distinguido de CpGs unmethylated pela presença de um &quot;C&quot; versus citosina timina &quot;T&quot; de resíduos durante o seqüenciamento. DNA de modificação pela conversão de bissulfito é um protocolo bem estabelecido que pode ser explorado para muitos métodos de análise de metilação do DNA. Desde a detecção de 5-MEC pela conversão de bissulfito foi primeiramente demonstrada por Frommer et al. 1 e Clark et al. 2, os métodos baseados em torno de conversão de bissulfito de conta de DNA genômico para a maioria dos novos dados sobre a metilação do DNA. Diferentes métodos de análise pós PCR podem ser utilizados, dependendo do grau de especificidade e resolução de metilação necessário. Clonagem e sequenciamento é ainda o método mais prontamente disponíveis que podem dar resolução de nucleotídeo único para metilação do outro lado da molécula de DNA.

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

A epigenética descreve as alterações hereditárias na função gênica que ocorrem independentemente da sequência do DNA. A base molecular da regulação epigenética dos genes...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise de metilação do DNA em dinucleotídeos CPG por meio do sequenciamento genômico de DNA convertido por sulfito. Isso é realizado primeiramente desnaturando o DNA de dupla fita, para que a reação de conversão por bisulfito possa ocorrer. O segundo passo consiste na conversão de todas as citosinas não metiladas no DNA genômico em uracila por desaminação com bisulfito.Esta reação envolve três fases. A primeira é a sulfatação do resíduo de citosina pela adição de bisulfito à ligação dupla entre os carbonos cinco e seis. Em segundo lugar, a desaminação hidrolítica da citosina pelo derivado de bisulfito produz um SSL pelo derivado de bisulfito, e em terceiro lugar, a remoção do grupo sulfonato por tratamento alcalino resulta em um resíduo de SSL.Em seguida, a região-alvo é amplificada por meio de primers específicos para conversão com bisulfito e amplificação por PCR. O passo final consiste na clonagem e sequenciamento do produto de PCR, fornecendo resolução de nucleotídeo único para a metilação ao longo da molécula de DNA. Em última análise, os resultados demonstram a metilação do DNA em dinucleotídeos CpG no DNA genômico, explorando a maior sensibilidade da citosina em relação à 5-metilcitosina à desaminação por bisulfito em condições ácidas.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de sangue southern, é que ela pode permitir resolução de um único nucleotídeo na metilação de DNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de epigenética, como o papel da metilação do DNA em doenças humanas como o câncer. Para preparar amostras de DNA para conversão com bisulfito, incube primeiro dois microgramas de DNA genômico com bisulfito, tampão de lise de DNA e um volume total de 18 microlitros durante uma hora a 37 graus Celsius.Em seguida, desnature o DNA genômico adicionando dois microlitros de hidróxido de sódio recém-preparado a três molar, obtendo uma concentração final de 0,3 molar. Incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos em banho-maria, seguido de incubação a 90 graus Celsius por dois minutos. Em um bloco térmico, coloque imediatamente os tubos em gelo por cinco minutos, centrifugue os tubos por 10 segundos a 10.000 Gs para garantir que o DNA esteja no fundo do tubo; as amostras de DNA desnaturado estão agora prontas para a desaminação em células B, que será demonstrada a seguir.Antes das reações de sulfatação e desaminação hidrolítica, prepare soluções frescas de quinol 10 milimolar e sulfito de sódio metabisulfito saturado em pH 5,0. Como o sulfito de sódio metabisulfito é uma solução saturada, pequenos grumos podem permanecer não dissolvidos. Adicione 208 microlitros do sulfito de sódio metabisulfito e 12 microlitros de quinol ao DNA desnaturado de 20 microlitros, em um volume final de 240 microlitros.Vortexe os tubos e centrifugue por 10 segundos para garantir que todas as gotas estejam na parte inferior do tubo. Cubra as amostras com óleo mineral. Incube as amostras a 55 graus Celsius em banho-maria por quatro a 16 horas, dependendo da quantidade e qualidade do DNA a ser convertido.É importante que a conversão com bisulfito ocorra no escuro para evitar oxidação. Ao final do tempo apropriado de incubação, centrifugue brevemente os tubos em uma microcentrífuga para garantir que todo o líquido esteja na parte inferior do tubo. Em seguida, pipete cuidadosamente a solução de DNA a partir da parte inferior do tubo, sem aspirar nenhum óleo mineral.Para as próximas etapas, nosso laboratório utiliza o sistema Promega Wizard de purificação de DNA. Adicione um mililitro de resina às amostras de DNA, inverta o tubo para misturar e, em seguida, aspire a solução com uma pipeta e transfira para uma seringa acoplada a uma coluna de dessalinização. Por fim, para remover quaisquer íons bisulfito livres, passe o DNA tratado com bisulfito pela coluna de dessalinização e elua em 50 microlitros de água Milli-Q.O próximo passo é remover o grupo bisulfito do anel de uracila por desaminação. Para isso, adicione 5,5 microlitros de hidróxido de sódio recém-preparado a 3 molar a cada amostra de DNA tratada com bisulfito, obtendo uma concentração final de 0,3 molar. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.Centrifugue brevemente as amostras e, em seguida, adicione um microlitro de TRNA a cada amostra. Neutralize a solução adicionando acetato de amônio até uma concentração final de três molar. Em seguida, precipite o DNA com etanol.Adicione 330 microlitros de etanol a 100%, gelado, e misture bem por inversão. Incube a menos 20 graus Celsius por uma hora até a noite toda, seguido de centrifugação a 14.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova completamente o sobrenadante e seque o DNA precipitado ao ar por aproximadamente 20 minutos.Após a secagem ao ar, o pellet é quase impossível de ver; ressuspenda o pellet de DNA em 50 microlitros de TE 0,1X ou água e deixe em temperatura ambiente por aproximadamente duas horas. Durante esse período, vorteixe os tubos ocasionalmente para garantir a dissolução do DNA, seguido por uma rápida centrifugação. Uma vez que o DNA estiver dissolvido, ele pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius por um a 10 anos, dependendo da quantidade e qualidade do DNA, ou pode ser usado imediatamente. Para amplificação por PCR, a otimização dos iniciadores é o aspecto mais difícil deste procedimento.Portanto, as seguintes orientações são fornecidas para ajudar a garantir o sucesso no design de primers. Para ilustrar essas orientações, a sequência-alvo foi convertida por sulfito, de modo que, quando escrita, as citosinas convertidas aparecem como Ts azuis e os sítios CPG não convertidos aparecem como cgs vermelhos. Os primers devem ter entre 24 e 30 pares de bases de comprimento para garantir especificidade. Os primers devem apresentar uma temperatura de melting (TM) prevista semelhante, acima de 50 graus Celsius, e não devem diferir em mais de um a dois graus Celsius.Os iniciadores devem conter múltiplas bases de C a T, aproximadamente 25%, para garantir a especificidade da conversão. A base final na extremidade três prima deve ser uma C a T para assegurar a amplificação de dinucleotídeos D-N-A-C-P-G convertidos. Os sítios C-P-G devem ser evitados na sequência do iniciador para evitar viés potencial em relação a modelos metilados, não metilados ou não convertidos. No entanto, se for inevitável, a citosina no sítio C-P-G deve ser substituída por um Y para ajudar a garantir uma amplificação imparcial do DNA convertido.Por fim, projete conjuntos de iniciadores aninhados ou semi-aninhados para garantir a especificidade ou sensibilidade da reação de PCR, se necessário. Prepare misturas de reação para amplificação por PCR em alíquotas de 25 microlitros para otimização. Cada reação contém DNA genômico convertido por sulfito, iniciadores DPS, cloreto de magnésio, cloreto de potássio, tris cloreto de hidrogênio pH 8,3 e anac polimerase para testar o viés de amplificação de material metilado ou não metilado.Utilize uma amostra controle 50% metilada e 50% não metilada, totalmente convertida por bisulfito, para testar a amplificação proporcional pela PCR com conversão por bisulfito. Use primers específicos e mistura de reação de PCR em um termociclador com gradiente de temperatura; configure a reação no gradiente, mais ou menos três graus Celsius a partir da TM do primer, em oito a 10 tubos. Vortexe os tubos e centrifugue brevemente em um microcentrífuga antes de colocá-los no termociclador. Esta figura mostra um gel de agarose com um perfil de amplificação PCR em gradiente de temperatura a partir de uma mistura de DNA 50% metilado e não metilado.Os amplicons de PCR e as linhas marcadas com T, linhas dois, cinco e oito, foram tratados com uma enzima de restrição que digere apenas DNA metilado; as condições ideais de amplificação por PCR devem amplificar amplicons metilados e não metilados em proporção e sem viés, resultando em uma quantidade igual de produto de PCR cortado e não cortado, como observado aqui. As condições ideais de termociclagem para amplificação não enviesada são de 55,6 graus Celsius. A conversão completa do DNA de bisulfito pode ser analisada por digestão com uma enzima específica para sítios de citosina, que digerirá apenas o DNA não convertido, linhas três, seis e nove.A conversão completa de DNA com bissulfito é indicada aqui pela ausência de DNA cortado em todas as três faixas, faixas três, seis e nove. Este gráfico de dissociação em tempo real mostra uma proporção igual de DNA metilado e não metilado, linha vermelho-laranja, mistura 50 50, em comparação com a amplificação controle de DNA totalmente metilado, linha rosa M, e não metilado, linha verde U, que se dissociam a 82,9 graus Celsius e 86,9 graus Celsius, respectivamente. Isso indica que não há viés de amplificação com base na temperatura na qual as diferentes moléculas se dissociam.Os fragmentos de PCR resultantes da amplificação de amostras tratadas com bisulfito podem ser visualizados por eletroforese em gel de agarose e sequenciados. É mostrado diretamente aqui um rastro de sequência de três linhagens celulares diferentes, com os sítios CPG destacados em amarelo; a linhagem celular X exibe 100% de metilação nos três sítios CPG, enquanto as linhagens celulares Y e Z mostram graus variáveis de metilação, conforme observado pelos sinais sobrepostos de GA exibidos aqui. A Figura quatro A é um rastro de sequência de três linhagens celulares diferentes, com os sítios CPG destacados em amarelo.Após o sequenciamento direto de clones individuais, o estado de metilação das moléculas individuais pode ser tabulado em um mapa de bisulfito. Para visualizar a metilação heterogênea, a densidade de metilação em sítios CpG individuais é mostrada em vermelho. Neste mapa de bisulfito representativo, análise quantitativa de alto rendimento da metilação de uma amostra.Utilizando a tecnologia Sequenom Epi Typer, é possível gerar um espectro específico dependente da presença de citosinas metiladas, como mostrado no exemplo da Figura cinco A. Um resumo das proporções na amostra pode então ser extrapolado na forma de um epígrafe, Figura cinco B. Este exemplo mostra a porcentagem de metilação de DNA em cada sítio CpG para quatro linhagens celulares diferentes. Finalmente, um resumo em forma de gráfico de metilação, Figura cinco C, pode ser derivado do epígrafe após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de epigenética explorarem a metilação do DNA e seu papel nas doenças humanas.

dna-methylation-bisulphite-modification-and-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Este vídeo demonstra o procedimento de modificação do bissulfito do DNA genômico de amostras de câncer gastrointestinal. A técnica é benéfica para investigar a relação entre os padrões de metilação dos genes e estabelecer sua contribuição para a carcinogênese.

Conversão de bissulfito de DNA genômico: um método para estudar a metilação do DNA em amostras de DNA genômico de tecido de câncer gastrointestinal

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

O presente estudo descreve o fluxo de trabalho para gerenciar dados de metilação de DNA obtidos por tecnologias de microarray. O protocolo demonstra passos desde a preparação da amostra até a análise de dados. Todos os procedimentos são descritos em detalhes, e o vídeo mostra os passos significativos.

Preparação amostral para análise bioinformática da metilação de DNA: Estratégia de Associação para Obesidade e Estudos de Traços Relacionados

PDMS Fabricação de dispositivos e modificação da superfície

Aprenda análise de metilação do DNA com resolução de nucleotídeo único usando conversão de bissulfito e sequenciamento genômico. Este método avançado permite distinguir citosinas metiladas e não metiladas em pesquisas de epigenética e câncer.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Explorar mais vídeos