Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar o mapeamento do destino e o rastreamento da linhagem de células individuais selecionadas em embriões de peixe-zebra. Isso é obtido conjugando quimicamente a fluoresceína enjaulada com a dextrana de alto peso molecular. Em seguida, o dextrano fluoresceína enjaulado preparado é microinjetado em embriões de peixe-zebra, que é então fotoativado em células selecionadas usando absorção de dois fótons.

Após a fotoativação dos embriões, a análise imuno-histoquímica é realizada para detectar a fluoresceína dextrana não enjaulada, a fim de mapear o destino das células ativadas. Em última análise, este método pode ser usado para determinar a contribuição da linhagem e a localização do tecido das células individuais fotoativadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia de fluorescência padrão, é que ela pode ser usada para rotular diferencialmente células individuais para mapeamento de fé.

Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como como as células precursoras indiferenciadas podem contribuir para diferentes tipos de tecido, A demonstração visual é crítica, pois as etapas de montagem do embrião e fotoativação são difíceis de aprender com base apenas na descrição do texto. Antes de começar, sintetize dextrano fluoresceína enjaulado e armazene-o em tubos cobertos com papel alumínio. Em seguida, microinjete embriões no estágio de uma a duas células com a fluoresceína dextrana sintetizada em gaiola.

Depois que os embriões atingirem o estágio apropriado de desenvolvimento, cubra-os. Em seguida, monte os embriões revestidos em aeros de baixo ponto de fusão para ativação fotográfica. Quando o surgiu solidificou carregar o software LSM cinco 10.

Coloque um filtro amarelo transparente no caminho do feixe de luz branca e, em seguida, selecione digitalizar nova imagem e clique em iniciar modo especialista. Selecione a guia do laser, ligue o ferro de argônio e as fontes de laser mi tai. Defina o comprimento de onda mi tai para sete 40 nanômetros.

Em seguida, selecione a guia de configuração. Defina as configurações do caminho óptico para o íon argônio e o laser mi tai. Em seguida, selecione a guia de digitalização.

Altere o objetivo para 20 vezes 0,8. Defina a velocidade máxima de varredura clicando em max, defina o método e o número do modo para a média da linha e um, respectivamente, na guia canais, desmarque todas as fontes de laser, exceto o mi tai. Em seguida, coloque um medidor de potência no caminho do feixe óptico e selecione o botão con para ativar a varredura contínua.

Ajuste a porcentagem de transmissão até que o medidor de potência leia uma potência média do laser de 47 miliwatts. Em seguida, pare a varredura selecionando o botão Parar na guia canais. Desmarque a fonte de laser mi tai e selecione o ferro argonne.

Em seguida, selecione o botão XY rápido novamente na guia de canais, ajuste o orifício. Detecte ganho, amplifique um deslocamento e amplifique novamente para que o laser de ferro Argonne obtenha a melhor qualidade de imagem. Usando o controlador de palco, localize e concentre-se na célula a ser ativada e clique no botão Parar Usando a ferramenta de corte, corte a célula ativada para que o fator de corte na guia de modo exiba de 50 a 70.

Em seguida, pare a varredura selecionando o botão de parada na guia canais. Desmarque o laser de íons argonne e selecione o laser My Tai na guia de modo. Defina a velocidade de varredura para 31,46 segundos.

Em seguida, selecione o botão único para iniciar a varredura para a ativação de dois fótons da fluoresceína dextrana enjaulada da célula selecionada. Após a ativação, vá para a guia de canais e agora desmarque o mi tai laser e selecione novamente o laser de íons de argônio. Em seguida, no modo, defina o fator de zoom como um. Próximo.

Sob o título de velocidade, clique no botão máximo para definir a velocidade de varredura mais rápida. Para revisar a região ativada pela foto, selecione xy rápido. Em seguida, selecione a guia de canais e ajuste o orifício e detecte novamente, verifique se a região ativada pela foto não está ablação a laser.

Depois de preparar os embriões fotoativados para imunodetecção de dextrana fluoresceína não enjaulada, seguindo o protocolo descrito no manuscrito anexo. Lave os embriões seis vezes em PBT e duas vezes em tampão AP. Em seguida, transfira os embriões para placas de nove poços em tampão AP.

Em seguida, aspire o buffer AP e adicione N-B-T-B-C-I-P. Pare o desenvolvimento da coloração N-B-T-B-C-I-P aspirando a solução N-B-T-B-C-I-P. Em seguida, lave os embriões em PBT.

Agora recupere os embriões e agite-os em uma plataforma giratória por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, repita o PBT de lavagem mais duas vezes. Finalmente, monte os embriões em aros de baixo ponto de fusão a 0,6% e adquira imagens das células fotoativadas usando um microscópio composto vertical.

Nesta figura, uma imagem de campo claro mostrada à esquerda e uma imagem fluorescente mostrada à direita de um embrião de peixe-zebra micro injetado com fio dex de fluoresceína enjaulado antes da ativação da foto. Como mostrado aqui, o embrião foi fotoativado em um dos somitos indicados pela seta na figura de campo claro à esquerda com um comprimento de onda de sete 40 nanômetros, um tempo de varredura de 31 segundos e uma potência média de laser de 47 miliwatts. Na figura à direita, após a fotoativação, a fluorescência da fluoresceína dextrana não enjaulada pode ser observada nesta figura.

A coloração imune de dextrana fluoresceína não enjaulada é representada em uma pequena região na placa lateral, mesoderma de um 10. Assim, o embrião em estágio de ácaro foi fotoativado usando os mesmos parâmetros de laser da figura anterior usando o procedimento de imunodetecção. A região ativada, conforme indicado aqui pela seta, pode ser identificada com o mínimo de coloração de fundo Seguindo este procedimento.

Análises adicionais, como imunocoloração para diferentes marcadores específicos de tecido, podem ser realizadas para melhor caracterizar a localização e o destino das células marcadas. Usando essa técnica, abre caminho para pesquisadores no campo da biologia vascular estudarem a origem das células progenitoras arteriais em células progenitoras venosas no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra. Não se esqueça de que, ao trabalhar com reagentes químicos como NBT e BCIP, eles podem ser extremamente perigosos e luvas devem sempre ser usadas.