Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar
1 de outubro de 2007
Demonstramos um método simples para colocar as células em locais desejados sobre um substrato. Este método padrões células lançando um chip de silicone contendo micropoços preenchidos com células na superfície do substrato. Este método oferece uma nova forma de modular a sinalização difusíveis e juxtacrine entre as células.
Sou Nickel Mital. Sou estudante de pós-graduação no laboratório Bowman. Hoje vou falar sobre um dispositivo desenvolvido por dois ex-alunos do nosso laboratório, chamado bio flip chip.
E este dispositivo permite a entrega de células sobre um substrato de escolha do pesquisador, em uma configuração também definida pelo pesquisador. Assim, o próprio dispositivo, do qual temos um exemplar aqui, é muito simples. Basicamente, consiste em pequenos poços em um pedaço de silicone.
Cada poço é normalmente projetado para acomodar apenas uma célula, mas, se necessário, podemos naturalmente torná-los maiores. A fabricação do dispositivo é realizada de modo que os poços apresentem a mesma disposição que as células eventualmente assumirão no substrato. Assim, o próprio dispositivo é fabricado utilizando litografia com materiais moles.
Em particular, utilizamos PDMS, que é poli(dimetilsiloxano), e moldamos a partir de uma pastilha de silício. Temos uma delas aqui. Assim, a própria pastilha molde é fabricada utilizando fotolitografia padrão para padronizar um fotoresiste SUA, que é depositado por centrifugação sobre a pastilha de silício.
Então, em resumo, as células são transferidas para o substrato de escolha preenchendo-se basicamente os poços do biochip com essas células. Em seguida, aplicamos o chip ao substrato desejado, frequentemente um cultivo de poliestireno para cultura de tecidos. Por fim, invertemos o conjunto, permitindo que as células saiam dos poços e depositem-se sobre o substrato.
Sou Stephanie Flavin. Sou pesquisadora de graduação no laboratório Goldman, e hoje demonstrarei como usar o bio flip chip para padronizar células no dia anterior. Queremos realizar um experimento de padronização.
Vamos ligar o PDMS a um lâmina de vidro de um por um polegada usando plasma. Em seguida, deixaremos o chip em imersão durante a noite, com o lado do poço voltado para baixo, em uma solução de PBS. Também cortaremos juntas para serem usadas no experimento de padronização e reuniremos grampos de lacre que também serão utilizados.
Aplicar 200 microlitros de BSA sobre a superfície de cada chip. Agitar a superfície do chip com a ponta da pipeta para remover bolhas e permitir que a solução de BSA preencha os poços. Deixar os chips sob a capela por uma hora sob luz UV em células de passagem UV conforme o normal.
Após uma hora, aspire a solução de BSA das lâminas e enxágue cada lâmina com 200 microlitros de PBS, aplicando em seguida 200 microlitros de solução de passagem de células numa densidade de 10⁶ células por mililitro. Após cinco a 10 minutos de espera para que as células sedimentem nos poços, lave a superfície da lâmina com PBS. Incline a lâmina para um canto, aproximadamente em um ângulo de 15 graus, e pipete lentamente a solução celular a partir do canto inferior da lâmina.
Retorne o chip ao nível e adicione lentamente 50 microlitros de PBS ao canto superior. Repita a etapa de lavagem quantas vezes forem necessárias. Uma vez que os xls tenham sido removidos da superfície do chip, adicione aproximadamente 50 microlitros de meio à junta interna do recipiente.
Adicione meio na parte superior de cada chip. Em seguida, inverta a placa e incline-a, abaixando-a sobre a superfície do chip, começando por um canto. Depois, aplane a placa sobre o chip de modo a evitar a formação de bolhas entre a placa e o chip.
Adicione clipes de papel em cada lado do chip para fixá-lo no lugar. Remova as alças de cada clipe de papel para que, ao virar o chip, ele fique nivelado sobre a placa. Transfira o chip para o incubador e vire rapidamente, evitando qualquer movimento desnecessário.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método inovador para posicionar células em um substrato utilizando um dispositivo denominado biochip flip. Ao inverter um chip de silicone com micropoços preenchidos com células sobre o substrato, os pesquisadores podem controlar efetivamente o posicionamento celular, aprimorando a modulação da sinalização entre as células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Neurociência
- Bioengenharia
Contexto
- A posicionamento celular é crucial para o estudo das interações celulares.
- Os métodos atuais podem apresentar falta de precisão no posicionamento celular.
- O biochip flip oferece uma solução simples e eficaz.
- Essa técnica pode influenciar tanto a sinalização difusível quanto a justacrina.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o posicionamento de células em substratos.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos de sinalização celular.
- Fornecer uma ferramenta para pesquisadores em diversas áreas biológicas.
Métodos Utilizados
- Projeto e fabricação do biochip invertido.
- Preenchimento de micropoços com células.
- Inversão do chip sobre o substrato desejado.
- Observação e análise da colocação celular e sinalização.
Resultados Principais
- Posicionamento bem-sucedido de células em locais específicos.
- Melhora na modulação da sinalização celular.
- Demonstração da facilidade de uso do dispositivo.
- Aplicações potenciais em diversos arranjos experimentais.
Conclusões
- O biochip reversível é uma ferramenta inovadora para o posicionamento celular.
- Este método pode impactar significativamente os estudos de sinalização celular.
- Pesquisas futuras podem expandir esta técnica para aplicações mais amplas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O controle espacial preciso de populações celulares permite a investigação mecanicista de vias de sinalização difusíveis e justacrinas essenciais para a validação de alvos em modelos de doenças baseados em células-tronco. O Bio Flip Chip oferece um método independente de substrato e que preserva a química para padronizar microambientes celulares definidos, apoiando o desenvolvimento reprodutível de ensaios para triagem fenotípica. Essa abordagem aumenta a confiabilidade preditiva no estágio inicial de descoberta ao reduzir a variabilidade no contato célula-célula e na exposição a fatores parácrinos, melhorando assim a continuidade translacional de modelos in vitro para validação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite testar hipóteses sobre como a densidade celular localizada e a disposição espacial influenciam as vias de diferenciação e autorrenovação de células-tronco.
- Valor Operacional: Elimina a variabilidade estocástica decorrente do semeador aleatório, garantindo entradas consistentes de sinalização juxtacrína e parácrina entre réplicas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao isolar a contribuição da sinalização dependente de contato versus sinalização solúvel em estudos de engajamento de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera matrizes celulares quantificáveis e espacialmente definidas, compatíveis com imagens de alto conteúdo e leituras multiplexadas.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios de interação célula-célula em policarbonato para cultura de tecidos, vidro, Matrigel e camadas de células alimentadoras, sem alterar a química do substrato.
- Escalabilidade: Compatível com impressão por microcontato para criar padrões de matriz extracelular, permitindo controle combinatório de sinais de adesão e sinalização.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Padroniza células-tronco embrionárias em nichos definidos para modelar vias de sinalização do desenvolvimento relevantes para distúrbios congênitos e medicina regenerativa.
- Modelagem Pré-clínica: Facilita a análise de resposta à dose de morfógenos ou terapêuticas em microambientes espacialmente controlados, aumentando a relevância fisiológica.
- Avanço com Ajuste de Risco: Reduz falsos positivos na identificação de compostos promissores ao minimizar ruídos provenientes de agregação celular não controlada ou frequência variável de contato.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O Bio Flip Chip integra-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce ao permitir o padrão reprodutível de células-tronco antes da exposição ao composto, apoiando triagem orientada por hipóteses e acompanhamento mecanicista na otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Testa como a organização espacial definida de células-tronco embrionárias modula a especificação de linhagem e a atividade de vias de sinalização.
- Triagem: Fornece substratos celulares padronizados e reprodutíveis para avaliar os efeitos de compostos sobre sinalização dependente de contato e sinalização difusível.
- Análise: Permite o mapeamento espacial quantitativo da expressão de marcadores, proliferação e apoptose como variáveis dependentes em co-cultivos padronizados.
- Pesquisa Translacional: Modela cascatas de sinalização do desenvolvimento humano em sistemas com controle espacial para orientar a seleção pré-clínica de alvos.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma modular de padronização adaptável a múltiplos tipos celulares, substratos e configurações de matriz extracelular em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir o ruído biológico decorrente de interações célula-célula não controladas.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade do ensaio por meio do posicionamento preciso de células definido pelo usuário, independente da variabilidade da técnica de semeadura.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de prosseguimento ou interrupção ao aumentar a relação sinal-ruído em telas fenotípicas voltadas para a comunicação intercelular.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de moduladores de vias juxtacrinas (por exemplo, Notch, Wnt) em áreas de doenças mediadas por células-tronco.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em litografia macia e manipulação de PDMS para a fabricação ou aquisição do chip.
- Depende do acesso a equipamentos de ligação por plasma e tratamento por UV/ozônio para a preparação do substrato.
- Necessita de protocolos padronizados de preparação e lavagem celular para garantir o carregamento e liberação eficientes nos poços.
- A adaptação a matrizes 3D ou sistemas microfluídicos pode exigir a otimização do tempo de inversão e da energia superficial.
- Limitação prática: A ocupação dos poços deve ser determinada empiricamente para cada tipo e tamanho celular, a fim de evitar o carregamento de múltiplas células em poços projetados para célula única.
