Name: Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprenda a padronizar células-tronco embrionárias usando o chip bio virar. Este método permite posicionar células com precisão em substratos, controlando a sinalização celular para estudos em biologia celular e bioengenharia.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder EB007278.

Fazendo uma BFC BFCs são feitos por moldagem PDMS (polidimetilsiloxano) sobre um wafer 4 master &quot;Si. Fazendo um wafer mestre <ol><li> Comece por desidratação as bolachas Si por 30 min a 130 ° C. </li><li> Coloque o wafer sobre um spin-coater, despeje SU8-2050 (Microchem) sobre o wafer, rampa de 300 rpm / s para 3000-4000 rpm, e giro por 30 s para produzir alturas característica de 40-30 mm, respectivamente. </li><li> Depois de girar, coloque a bolacha em um 65 ° C placa, imediatamente rampa até a temperatura a 95 ° C por 5-6 min, em seguida, rampa para baixo a 65 ° C. </li><li> Expor as bolachas a uma dose de UV de 200 mJ / cm 2 em um alinhador de contatos usando uma máscara de campo escuro. </li><li> Coloque as bolachas em uma placa 65 ° C, imediatamente rampa até a temperatura para 95 ° C por 4-5 min, em seguida, rampa para baixo a 65 ° C. </li><li> Desenvolver as bolachas em acetato de PM e Isopropanol. </li><li> Silanizadas as bolachas por 30 min usando hexametildisilazano (Shin-Etsu MicroSi), ou (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (t2492 KG, Especialidades UCT, Bristol, PA), para evitar de PDMS aderindo ao mestre wafer de silício. </li></ol> Fichas de moldagem <ol><li> Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) em uma proporção de 10:1, despeje-o sobre a bolacha Si master (~ g 15 por wafer), e deixe-o cura de noite à temperatura ambiente. </li><li> Descasque as curada PDMS fora do wafer Si e cortar cada chip usando uma lâmina de barbear. </li><li> Vínculo cada chip para uma lâmina de microscópio 1x1 centímetros corte para fácil manuseio. </li></ol> Preparando o BFC para uso <ol><li> Embeber o overnight BFC em PBS, a fim de prevenir a absorção de mídia no PDMS durante o experimento. </li><li> Seca os chips com um Kimwipe (Kimtech Science). </li><li> Coloque uma gota de 7,5% albumina sérica bovina (BSA) (~ 200 mL) na superfície padronizada do BFC, e depois raspá-lo com uma ponta de pipeta para dispersar a BSA e retire as bolhas dos poços. </li><li> Deixe a BSA na superfície BFC por pelo menos 0,5 horas. O ideal é agitar a BSA a cada 15 minutos para evitar que crostas. </li><li> Para se ajustarem ao BFC dentro de um prato de 35x10 milímetros TCPS (Falcon, 35-3001), corte as bordas de uma maneira TCPS prato meia para baixo de modo que a ¾ &quot;binder clips (Office Depot) caberá ao longo da borda prato para prender o chip e prato juntos. </li><li> Cortar uma junta espaçador (frame-moldado com 20&#39;20 borda externa milímetros, borda milímetros 15&#39;15 interior, e 250-500 mm de espessura) de uma folha de PDMS (Specialty Products Silicone) ou qualquer outro silicone, e aplicá-lo ao prato usando uma pinça. </li></ol> Células com uma padronização BFC <ol><li> Esterilizar o prato, junta, BSA revestido chip, e 2 grampos da pasta sob luz UV durante 1 minuto. </li><li> Aspirar a BSA e lavar o BFC duas vezes com 200 mL PBS. </li><li> Adicione a gelatina ao prato TCPS corte se necessário para o seu celular-line. Caso contrário, a superfície molhada TCPS com alguns meios de comunicação antes de aplicá-lo para o chip (veja abaixo). Isso evita que se formem bolhas na câmara. </li><li> Após aspiração do PBS, pipetar 200 mL de solução de célula (~ 1 × 10 6 células / mL) sobre a superfície BFC. Permitir que as células se contentar com 5-10 min. </li><li> Incline o BFC para um canto em um ângulo de 15 ° ~ e, lentamente, a solução da pipeta celular desligado, com uma pipeta de 200 mL. Então, coloque o flat BFC e adicionar 100 mL de PBS ou mídia em branco para o canto oposto BFC. Lavar o BFC desta forma um adicional de 2-4 vezes, se necessário, para limpar todas as células das regiões inter-bem. </li><li> Pipetar 200 mL da mídia sobre a superfície do chip. Aspirar gelatina / media da TCPS. Em seguida, inverta o prato pré-molhada e lentamente empurre para cima BFC, no prato. </li><li> Aplique uma pasta de cada clipe, a dois lados da câmara para selá-lo. Remova os pinos de metal da grampos da pasta, para que prato permanece nível quando capotou. </li><li> Finalmente, virar rapidamente a configuração mais, evitando qualquer movimento desnecessário, e colocá-lo na incubadora. </li></ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

Embora o protocolo e vídeo mostrado aqui descrevem como usar o BFC um padrão de células-tronco embrionárias de rato (mESCs), BFCs pode ser usado para padrão de praticamente qualquer tipo de célula de interesse. A única mudança pode-se precisar fazer é alterar o tamanho das microcavidades. Em nossa experiência, para usar o BFC às células padrão único de outro tipo de célula, um diâmetro de micropoços e altura igual a 10 microns maior que o diâmetro das células unattached funciona melhor. BFCs também pode ser usado para as ...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Molde-mestre de silício</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Grampos de 3/4&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hexametildisiloxano</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novo Item</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de PM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7,5% Albúmina Sérica Bovina</td></tr></tbody></table>

padronização de células-tronco embrionárias usando o chip bio virar

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Interações célula-célula consistindo de sinalização e difusíveis contato célula-célula (sinalização juxtacrine) são importantes em vários processos biológicos como o crescimento do tumor, a diferenciação de células-tronco, células-tronco e auto-renovação. Uma série de métodos existem atualmente para modular sinalização celular in vitro. Um método de modular a quantidade total de sinalização difusíveis é variar a densidade de semeadura de células durante a cultura. Devido à natureza aleatória de semeadura de células, isso resulta em uma considerável variação no espaçamento célula-real ea quantidade de contato célula-célula, e não pode prescrever o meio ambiente local. Uma abordagem mais específica para a sinalização celular modular é a utilização de inibidores moleculares ou abordagens genéticas para derrubar proteínas específicas de sinalização, mas ambos os métodos são mais adequados para a manipulação de um pequeno número de moléculas. Aqui, nós demonstramos uma nova abordagem para sinalização célula-célula de modulação que modula o meio ambiente local de um aglomerado de células, colocando números diferentes de células nos locais desejados sobre um substrato. Este método oferece uma forma complementar para controlar a sinalização local difusíveis e juxtacrine entre as células. Nosso método faz uso do Chip Bio Flip (BFC), um chip de silicone microfabricated contendo centenas-de-milhares de micropoços, cada tamanho para segurar ou uma única célula ou um pequeno número de células. Nós carregar o chip com células simplesmente pipetando-los para a matriz de poços e lavar as células descarregado fora do array. O chip é então colocado sobre um substrato, no qual as células saem dos poços e na superfície do substrato, mantendo a sua padronização. Depois que as células têm ligado, o chip pode ser removido (ou deixadas por diante). Esta abordagem para padronização celular é o único que: 1) não altera a química do substrato, permitindo assim que as células a proliferar e migrar; 2) permite modelar em qualquer substrato, incluindo da cultura de tecidos de isopor, vidro, Matrigel, e mesmo alimentador de camadas de células, e 3) é compatível com a impressão microcontact tradicional, permitindo a criação de ilhas de matriz extracelular com células colocadas dentro dessas ilhas. Neste vídeo, demonstramos a padronização de células-tronco embrionárias de camundongos em cultura de tecidos de poliestireno utilizando o BFC.

Demonstramos um método simples para colocar as células em locais desejados sobre um substrato. Este método padrões células lançando um chip de silicone contendo micropoços preenchidos com células na superfície do substrato. Este método oferece uma nova forma de modular a sinalização difusíveis e juxtacrine entre as células.

Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar

As interações célula-célula, compostas por sinalização difusível e contato célula-célula (sinalização justacrina), são importantes em inúmeros processos biológicos, tais como...

Sou nickel Mital. Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Bowman. Hoje vou falar sobre um dispositivo desenvolvido por dois ex-alunos do nosso laboratório, chamado bio flip chip.E este dispositivo permite a entrega de células sobre um substrato de escolha do pesquisador, em uma configuração também definida pelo pesquisador. Assim, o próprio dispositivo, como este que temos aqui, é muito simples. Ele consiste basicamente em pequenos poços em um pedaço de silicone.Cada poço é geralmente projetado para acomodar apenas uma célula, mas, se necessário, é claro que podemos torná-los maiores. A fabricação do dispositivo é realizada de modo que os poços apresentem a mesma disposição em que as células acabarão por se posicionar no substrato. Assim, o próprio dispositivo é fabricado utilizando litografia com materiais moles.Em particular, utilizamos PDMS, que é o poli(dimetilsiloxano), e moldamos a partir de uma pastilha de silício. Temos uma delas aqui. Assim, a própria pastilha molde é fabricada utilizando fotolitografia padrão para padronizar um fotoresiste SUA, que é espalhado sobre a pastilha de silício.Então, em resumo, as células são transferidas para o substrato de escolha pr

patterning-of-embryonic-stem-cells-using-the-bio-flip-chip

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Micro-escala de Engenharia de Biologia Celular

Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Este vídeo mostra a criação de um chip de barreira hematoencefálica usando células precursoras derivadas de iPSC. Envolve a semeadura de células progenitoras neurais e células endoteliais microvasculares cerebrais em canais separados com uma membrana porosa. Ao fluir meios de diferenciação, as células endoteliais formam junções apertadas semelhantes a vasos sanguíneos, e as células neurais amadurecem em vários tipos de células cerebrais, estabelecendo uma barreira hematoencefálica funcional no...

Gerando um chip de barreira hematoencefálica usando células precursoras derivadas de iPSC

células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

O método aqui apresentado utiliza micropadronização em conjunto com a imagem quantitativa para revelar a organização espacial dentro das culturas de mamíferos. A técnica é fácil de estabelecer em um laboratório de biologia celular padrão e oferece um sistema tratável para estudar padronização in vitro.

Mapeando a organização espacial emergente de células de mamíferos usando Micropatterns e imagens quantitativas

Os ligantes da matriz extracellular podem ser modelados em hidrogéis do poliacrilamida para permitir a cultura de pilhas de haste embrionário humanas em colônias confinadas em carcaças complacentes. Este método pode ser combinado com a microscopia da força da tração e os ensaios bioquímicos para examinar o interação entre a geometria do tecido, as forças pilha-geradas, e a especificação do Fate.

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este artigo apresenta métodos para o crescimento de miócitos cardíacos com diferentes formas, que representam diferentes patologias, e classificação desses miócitos cardíacos aderentes com base em sua morfologia a um único nível celular. A plataforma proposta fornece uma nova abordagem para o alto rendimento e triagem de drogas para diferentes tipos de insuficiência cardíaca.

Uma abordagem para estudar transcriômica dependente de forma em um único nível celular

Aqui apresentamos um protocolo para células de micropattern em resolução unicelular usando a adesão programada pelo DNA. Este protocolo usa uma plataforma de fotolitografia benchtop para criar padrões de oligonucleotídeos de DNA em um slide de vidro e, em seguida, rotula membranas celulares com oligonucleotídeos complementares disponíveis comercialmente. A hibridização dos oligos resulta em adesão celularprogramada.

Padronização simples, acessível e modular de células usando DNA

Um protocolo para a cultura e manipulação do tecido embrionário do rato em um chip microfluido é fornecido. Aplicando pulsos de moduladores de via, este sistema pode ser usado para controlar externamente as oscilações de sinalização para a investigação funcional da sonorênese do mouse.

Uma abordagem microfluidics para a investigação funcional de oscilações de sinalização que regem a Somitogênese

Aprenda a padronizar células-tronco embrionárias usando o chip bio virar. Este método permite posicionar células com precisão em substratos, controlando a sinalização celular para estudos em biologia celular e bioengenharia.

Padronização de Células-Tronco Embrionárias Usando o Chip Bio Virar

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