Name: Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda o método de cut-loading para avaliar o acoplamento por junções comunicantes entre neurônios da retina intacta usando neurobiotina como traçador. Esta técnica facilita o estudo de sinapses elétricas sob condições controladas de iluminação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder EY005102 para SCM e EY018640 para CPR

1. Intacta retina neural preparações para goldfish, camundongos e coelhos <ol><li> Realizar todas as etapas a seguir, incluindo aqueles descritos em "2) Corte-loading", sob constante iluminação ambiente (background). Por favor, note que, para efeitos deste protocolo, os procedimentos são descritos como a realizada na escuridão constante (isto é, com muito escuro (ou seja, "escotópica") condições ≤ 0,0001 lux) usando óculos de visão noturna infravermelha, mas outros níveis de maior intensidade de iluminação ambiente constante pode ser usado em vez de determinar o efeito de outros níveis de iluminação ambiente em gap de acoplamento junção marcador. </li><li> Dark-se adaptar o animal experimental (mouse goldfish, ou coelho) por pelo menos 1 hora antes da cirurgia. </li><li> Conforme descrito anteriormente 7, profundamente anestesiar peixinho colocando-os em tricaina metanosulfanato (MS222, 150 mg / L de água tamponada (bicarbonato de sódio contendo) do tanque de peixes), e profundamente anestesiar ratos com cetamina (100 mg/ Kg, ip) e Rompun (10 mg / kg, ip). Profundamente anestesiar coelhos com uretana (dose de ataque: 2,0 g / kg, ip) e também usar anestesia intraorbital local (2% xilocaína), como descrito anteriormente 8. Todos os procedimentos experimentais envolvendo o cuidado e uso de animais deve ser realizada de acordo com as diretrizes federais e ser revisado e aprovado pelo cuidado animal local da universidade e comitês uso. (Nota:. Nos experimentos aqui descritos, todos os procedimentos experimentais envolvendo o cuidado e uso de peixes, camundongos e coelhos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e foram revistos e aprovados pela Ohio State University Animal Care Institucional e Comitê de Uso) </li><li> Para peixes, camundongos e coelhos, após enucleação, remova a parte anterior de cada globo ocular. Em seguida, coloque um pedaço de papel de filtro em cima da porção posterior do olho e inverter o papel de filtro e do olho, de modo que o papel de filtro fica embaixo da porção posterior do olho. Em seguida, usando bemforceps dissecar a retina neural intacta da parte posterior do olho suavemente descascar o epitélio pigmentar / coróide / esclera, que são ligados uns aos outros, a partir da retina neural, que é ligado ao papel de filtro. Como isso é feito, cortou o nervo óptico usando multa de mola tesoura. A retina neural, até fotorreceptoras lado-oriented, agora deve ser anexado ao papel de filtro e separado do resto do olho. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Submergir o retinas em solução Ringer oxigenados (Tabela 1) em uma placa de 6 poços (~ 5 mL / poço) por 30 min sob constante ambiente (background) iluminação (por exemplo, sob muito escuro (ou seja, "escotópica") condições) com ou sem uma droga teste. Manter retinas de peixes em oxigenada (5% CO 2 / 95% O 2) de bicarbonato baseado em Ringer a 22 ° C por selar a placa de 6 poços com parafilme e manter retinas do rato e coelho em 36 ° C em 5% de CO 2 / 95% O <li> Prepare a solução marcador (tipicamente 100 mL) pela dissolução neurobiotin (0,5%), uma molécula de biotina, em solução de Ringer imediatamente antes do corte através da retina. Note-se que 0,5% rodamina dextran (alta (&gt; 10.000) MW) pode ser adicionado à solução. Devido ao seu alto peso molecular, rodamina dextran não atravessa junções e as células apenas rótulos que foram danificadas pelo corte. Como mostrado na figura. 3, esta é uma maneira útil para distinguir as células que se acumularam neurobiotin por terem sido feridos, daqueles que acumularam o marcador por difusão através de junções. </li><li> Coloque a solução neurobiotin em um vidro (ou plástico) placa de Petri, toque no papel filtro, para que a retina está ligado, em um papel toalha para remover excesso de Ringer, mergulhe uma lâmina de barbear (ou lâmina afiada outros) na solução e neurobiotin on fazer um corte radial através da retina e papel de filtro. Se preferir, espaçadores podem ser usadas para que o corte é feito através da retina, mas não o papel de filtro. O corte deve ser orientadas perpendicularmente à superfície da retina. Mergulhe a lâmina de barbear na solução neurobiotin novamente e cortar a retina uma segunda vez. Repita este até 4 cortes por retina (ver Fig. 1.). Use um microscópio de dissecação ao fazer cortes de navalha pelo mouse e outros pequenos retinas. </li><li> Como mostrado na figura. 1 submergir, a retina de novo em meio Ringer frescas, com ou sem drogas teste, usando uma placa de 6 poços (5 mL de Ringer / poço). Incubar a retina de 15 min para permitir a carga e difusão. </li><li> Lavar três vezes por 5 min cada um com média Ringer frescas, com ou sem drogas teste. </li><li> Fixar a retina com paraformaldeído a 4% em 0,1 M fosfato tampão (PBS, pH 7,4) por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Lave com 0,1 M PBS overnight a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, reagir wom 2% estreptavidina-Alexa 488 (concentração final 10 mg / mL) em 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, e manter durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar três vezes por 10 min cada um com 0,1 M PBS a RT </li><li> Em PBS, descolar a retina do papel de filtro e, em seguida, usando um pincel fino, coloque a retina, até fotorreceptoras lado-oriented, em um slide. </li><li> Suavemente montar com Vectashield meio de montagem (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Tirar fotos com um microscópio confocal de varredura a laser (por exemplo, Zeiss 510 META) na mesma ampliação, resolução e configurações para cada condição experimental, de modo que você pode comparar os efeitos de diferentes condições experimentais (teste de drogas, por exemplo, condições de iluminação) sobre a extensão da gap junção traçador de acoplamento (Fig. 2A-C e Figo. 4A-C). Embora uma única imagem pode conter todas as células marcadas, é recomendado que você coletar um z-stack da área de interesse e recolhê-la em um únicoda imagem. </li></li></ol> 3. Quantificação do traçador acoplamento com ImageJ <ol><li> No navegador de imagem LSM, abra a imagem, clique em Exportar e salvar a imagem como um pouco TIF-16 NÃO arquivo compactado. Barra de escala devem ser incluídos nesta imagem TIF. </li><li> NIH utilizando software ImageJ, medir a intensidade de fluorescência de Alexa-488-rotulados neurobiotin de ampliação de imagens de baixa todo-mount retinas. Abra o arquivo TIF utilizando o software ImageJ e desenhe uma linha reta correspondente à barra de escala. Ir para ANALISAR, SET SCALE e digite a distância conhecida e unidade de comprimento, em seguida, clique em OK. Agora os resultados da medição podem ser apresentados em unidades calibradas, como milímetros. </li><li> Selecione a área de interesse usando a ferramenta de seleção retangular. O pico de fluorescência deve ser posicionada na borda esquerda de sua seleção. Certifique-se que não há nenhum sinal de fluorescência perto da borda direita. Se não, rodar a imagem ativa (IMAGE, então ROTATE). </li><li> CliqueAnalisar e PLOT PERFIL. Você deverá ver uma curva com um decaimento exponencial da esquerda para a direita. </li><li> Clique em Copiar na janela pop-up e cole no EXCEL. Agora você vê duas colunas mostrando a distância do corte (coluna da esquerda) e da intensidade de fluorescência em função da distância a partir do corte (coluna da direita). </li><li> Divida cada valor bruto de fluorescência pelo valor máximo de fluorescência para obter a intensidade relativa de fluorescência. </li><li> Copiar duas colunas correspondentes à distância entre o corte (X) ea intensidade de fluorescência relativa (Y), e depois colá-los no software Origin. </li><li> Fit com o decaimento exponencial função # 1 (Fig. 2D e Fig. 4D.), Que está na forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) onde Y é a intensidade relativa de fluorescência, o Y é a fluorescência de fundo, Y max é o máximo relativo de fluorescência, λ é o space (comprimento) constante, e x é a distância entre o corte. </li><li> Compare o espaço constante (λ) valores em diferentes condições experimentais utilizando o t-test ou ANOVA (Fig. 2E e Figo. 4E). Note-se que técnicas alternativas de quantificação têm sido descritos por outros 13,14. </li></ol> 4. Resultados representante Exemplos representativos de células fotorreceptoras traçador de acoplamento, conforme determinado pelo corte de carga são apresentados nas Figuras 2 e 3 (peixes) e Figura 4 (coelho). Confocal imagens foram tiradas usando as mesmas configurações para comparação (Fig. 2A-C e Figo. 4A-C) ea intensidade de fluorescência foi plotado como uma função da distância a partir do corte e equipados pela função exponencial mostrada na No. 3,8 acima (Fig. 2D e Figo. 4D). Valores de espaço constante para cada condiçãosão mostrados nas Figuras 2E e 4E, ilustrando que a extensão do gap de acoplamento junção traçador pode ser quantificada usando a técnica de corte de carga. Além disso, os resultados são altamente reprodutível. Utilização da técnica de corte-carregamento como um meio de quantificar o grau de abertura de acoplamento junção traçador também é validado pela constatação de que a intensidade de fluorescência diminui exponencialmente como uma função da distância entre o corte em todos os casos examinados 7,8 (ver também Figs. 2D e 4D aqui), indicando que entrou no neurobiotin fotorreceptores através do corte de navalha, e não de outros sites da retina. Além disso, a diferença qualitativamente similares dia / noite em fotorreceptoras acoplamento marcador de células observadas em goldfish com injeções de traçador em cones simples e com corte de carga-7 substancia corte de carga, como um meio relativamente precisas de medir a extensão do acoplamento fotorreceptoras. O corte-lOLOCAR técnica também pode ser usado para investigar outros tipos de sinapses elétricas na retina. Por exemplo, a Figura 5 ilustra esse coelho tipo A (Fig. 5A) e tipo B (Fig. 5B) células horizontais exibem homóloga tracer acoplamento seguintes corte de carga ea difusão das neurobiotin sob condições de adaptação ao escuro. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Peixe </td><td> Mouse </td><td> Coelho </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composição das soluções de Ringer para mouse goldfish e retinas de coelhos. As concentrações são apresentados em mM. Soluções de Ringer são aeradas com 5% de CO 2 / 95% O 2 e mantidos a 22 ° C (peixe) ou 36 ° C (mamíferos). "-": Não incluídos na campainha para esta espécie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Fluxograma mostrando o procedimento de corte de carga. Após o isolamento of intacta retina neural, vários cortes radiais foram feitas por uma lâmina que foi mergulhado em solução neurobiotin 0,5%. A retina foi incubado por tracer carga e difusão, e depois lavadas antes de fixação com paraformaldeído a 4% (PFA) em 0,1 M tampão fosfato (PB). Tracer acoplamento foi examinada usando-estreptavidina conjugados Alexa-488. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Vigília-diferença no marcador no fotorreceptor acoplamento peixinho é revelada pela técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junção neurobiotin acoplamento traçador foi extensiva à noite (B) e no dia seguinte à aplicação de Espiperona (10 mM), uma seletiva de dopamina D antagonista do receptor 2 (C), mas não no dia, sob condições de controle (A). D) intensidade relativa normalizada fluorescentes como uma função da distância dos cortes (indicado por setas em AC). E) val espaço constanteues obtidos a partir dos dados em experimentos D e outros (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Um exemplo representativo mostrando fluorescência na camada de células fotorreceptoras de uma retina de adaptação ao escuro da noite seguinte goldfish corte de carga com uma solução de ambos os neurobiotin e dextran rodamina. Rodamina dextran (mostrada em vermelho), que não se difunde através de canais de espaço aberto junção devido ao seu alto peso molecular (&gt; 10.000 MW), apenas células marcadas perto do corte. Em contraste, neurobiotin (mostrado em verde) difundida através de junções e pode ser visto em células fotorreceptoras longe da corte. A localização do corte é indicado pela seta em cada painel. Barra de escala: 200 mM. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Day noite diferemcia no fotorreceptor tracer acoplamento em retina de coelho é revelada pela técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junção neurobiotin acoplamento traçador foi extensiva à noite (B) e no dia seguinte à aplicação de Espiperona (10 mM) (C), mas não no dia, sob condições de controle (A). Na AC, vistas perpendicular da reconstrução 3D de fotorreceptores coelho perto do corte são mostrados. D) intensidade relativa normalizada fluorescentes como uma função da distância dos cortes. E) valores Espaço constante obtida a partir dos dados em experimentos D e outros (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cut-loading revela que de adaptação ao escuro coelho células horizontais são tracer acoplados. Tanto do tipo A-(A) e tipo B (B) em células horizontais de adaptação ao escuro retinas de coelhos expostos homóloga neurobiotin acoplamento marcador.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li>
<li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li>
<li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li>
<li>Bloomfield, S. A., Völgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li>
<li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Brain.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li>
<li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li>
<li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li>
<li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li>
<li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li>
<li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Commun.+Adhes%22%5BJournal%5D)">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li>
<li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li>
<li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li>
<li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de corte de carga descrito aqui é uma técnica útil e simples para determinar a extensão da brecha de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina em condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite. Vantagens desta técnica incluem a capacidade de quantificar a extensão do hiato de acoplamento tracer junção entre neurônios no tecido da retina intacta sob uma variedade de condições de iluminação durante o dia e noite, para fazê-lo para os neurônios acoplados que somata de pequeno diâmetro. Limitações da técnica no estudo de junções em queda tecido intacto em duas categorias gerais. Primeiro, tracer difusão através junções abertas pode ser relativamente difícil de observar devido a um) o diâmetro pequeno ou da carga associada com os canais abertos e b) os volumes relativos dos compartimentos celulares acoplados 1,14,15. Isto é, difusão traçador de uma célula pequeno para um celular ou um grupo de células acopladas, compared à difusão de um traçador célula maior para um menor de células, podem ser mais difíceis de detectar devido à diluição do marcador. Segundo, sob algumas condições fisiológicas, a extensão da difusão através tracer junções no tecido intacto pode não refletir a força da condutância juncional gap devido a diferenças na condutância de pequenos corrente elétrica de transporte de íons, em comparação com a permeabilidade do marcador relativamente grande moléculas 1,14,15. Em geral, as evidências de marcador de acoplamento sugere fortemente a presença de funcionamento, os canais de junção aberta lacuna, mas sob algumas condições fisiológicas, a difusão de traçador pode não ocorrer ou ser observado ainda que as gravações eletrofisiológicas sugerem a presença de funcionamento, junções abertas. Parece provável que a técnica de corte de carga também pode ser usado para investigar o grau de abertura de acoplamento tracer junção entre os neurônios no tecido intacto de outras regiões do sistema nervoso centraltem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Tricaina sulfonato de metano (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L de água tamponada tanque de peixes </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 doses g / kgloading </td></tr><tr><td> Tubo duplo Night Vision Goggle </td><td> Noite Optics EUA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> O filtro de papel, No. Grau 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça fina, Dumont n º 5, Biologie, 11 cm de comprimento </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Tesoura fina, de mola, 8 blade mm, em linha reta </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vetor </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Estreptavidina conjugada Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rodamina (alta (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield meio de montagem </td><td> Vetor </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 Laser Scanning META microscópio confocal </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Software ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: uma ferramenta útil para examinar a extensão da gap coupling tracer junção entre neurônios da retina

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Além da transmissão sináptica química, os neurônios que são conectados por junções também podem se comunicar rapidamente via transmissão sináptica elétrica. Crescentes evidências indicam que as junções não só permitem o fluxo de corrente elétrica e atividade síncrona entre as células interligadas ou acoplados, mas que a força ou a eficácia da comunicação elétrica entre as células acopladas pode ser modulada para um 1,2 em grande medida. Além disso, o diâmetro interno grande (~ 1,2 nm) de canais de derivação muitos gap permite não apenas o fluxo de corrente elétrica, mas também a difusão de moléculas sinalizadoras intracelulares e metabólitos pequena entre as células interligadas, de modo que junções podem também mediar a comunicação metabólica e química . A força da comunicação juncional gap entre os neurônios e sua modulação por neurotransmissores e outros fatores podem ser estudados em simultâneo eletricamente gravação a partir de células acopladas e determinando ta amplitude de difusão de moléculas de traçador, que são permeáveis ​​junção gap, mas não membrana permeável, após a injeção de iontoforese em células individuais. No entanto, estes procedimentos podem ser extremamente difícil de executar em neurônios com somata pequena no tecido nervoso intacto. Numerosos estudos sobre sinapses elétricas ea modulação da comunicação elétrica foram realizados na retina dos vertebrados, uma vez que cada um dos cinco tipos de neurônios da retina é eletricamente conectados por junções gap 3,4. Crescente evidência mostrou que o relógio (24 horas) circadiano da retina e alterações na estimulação luminosa regular junção gap acoplamento 3-8. Por exemplo, trabalhos recentes têm demonstrado que o relógio circadiano da retina diminui o acoplamento gap junção entre haste e células fotorreceptoras cone durante o dia, aumentando a ativação do receptor de dopamina D2, e aumenta consideravelmente a haste cone de acoplamento durante a noite, reduzindo a ativação do receptor D2 <sup&gt; 7,8. No entanto, não são apenas estes estudos extremamente difícil de executar em neurônios com somata pequena no tecido neural intacta retina, mas pode ser difícil de controlar adequadamente as condições de iluminação durante o estudo eletrofisiológico de neurônios da retina única para evitar a luz induzida por mudanças na junção gap condutância. Aqui, apresentamos um método simples de determinar a extensão da abertura de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina em condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite. Esta técnica de corte-carregamento é uma modificação da carga raspar 12/09, que é baseada na carga do corante e difusão através de canais de junção aberta lacuna. Loading raspar funciona bem em cultura de células, mas não em fatias grossas, tais como retinas intactas. A técnica de corte-carregamento tem sido utilizado para estudar o acoplamento de fotorreceptores em retinas de peixe intacto e mamíferos 7, 8,13, e pode ser usado para estudar o acoplamento entreoutros neurônios da retina, como descrito aqui.

Um método fácil e conveniente para determinar a extensão do hiato de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina é descrito. Esta técnica permite uma para investigar a função das sinapses elétricas entre os neurônios na retina intacta sob condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite.

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

Além da transmissão sináptica química, os neurônios que estão conectados por junções comunicantes também podem se comunicar rapidamente via sinapses elétricas...

O objetivo geral do seguinte experimento de carregamento por corte é examinar o grau de acoplamento por meio de junções comunicantes entre neurônios na retina intacta sob condições controladas de iluminação. O primeiro passo é realizado cortando as retinas com uma lâmina afiada mergulhada em uma solução de neurobiotina, uma molécula rastreadora que pode difundir-se através de canais de junções comunicantes abertos, mas não através das membranas celulares. No segundo passo, as retinas são incubadas em solução de Ringer, o que permite a difusão do rastreador através dos canais de junções comunicantes abertos.Se o acoplamento por junções do tipo fenda for fraco, a fluorescência da biotina neural será restrita aos neurônios retinianos próximos ao corte. Em contraste, se o acoplamento por junções do tipo fenda for forte, a fluorescência será detectada em neurônios retinianos distantes do corte. A principal vantagem do carregamento por corte em relação às técnicas existentes é que ele é mais fácil de realizar em neurônios com corpos celulares pequenos em tecido retiniano neural intacto.Também é mais fácil controlar as condições de iluminação durante o carregamento com cortes do que durante um estudo eletrofisiológico de neurônios individuais em tecido retiniano intacto. Porque os estímulos luminosos utilizados durante a gravação elétrica podem por si mesmos provocar alterações no acoplamento por junções comunicantes, demonstrando a técnica será o Dr. Chu Choi, um pós-doutorando do meu laboratório. Neste procedimento, um peixe-dourado é mantido em escuridão constante durante o dia por pelo menos uma hora antes da cirurgia, e todos os passos seguintes até a fixação do tecido retiniano também são realizados durante o dia em escuridão constante, anestesiando profundamente o peixe-dourado mediante adição de 150 miligramas por litro de metano sulfonato à água do aquário.Em seguida, sacrifique o peixe-dourado de acordo com as diretrizes federais e universitárias e remova cuidadosamente seus bulbos oculares. A seguir, remova a porção anterior de cada bulbo ocular. Então, coloque um pedaço de papel de filtro sobre a porção posterior do olho e inverta o papel de filtro e o olho, de modo que o papel de filtro fique abaixo da porção posterior do olho.Agora, remova suavemente a parte posterior do olho, incluindo a esclera e o epitélio pigmentado do peixe dourado adaptado à escuridão. Corte o nervo óptico da retina com uma pinça fina. A retina neural do peixe dourado, com a face dos fotorreceptores voltada para cima, deve agora estar aderida ao papel filtro antes da enucleação, enquanto o peixe está sob anestesia em cinco mililitros de solução ringer à base de carbonato oxigenada, com ou sem a droga em teste, adicionada a cada poço de uma placa de seis poços, após a dissecação da retina neural intacta da porção posterior do olho.Transfira as retinas para os poços durante a escuridão constante. Em seguida, feche os poços com paraforma e deixe o tecido incubando por 30 minutos. Prepare 100 microlitros de solução traçadora dissolvendo 0,5% neuro biotina em solução de Ringer imediatamente antes de cortar através da retina.Em seguida, adicione a solução de biotina neural a uma placa de Petri de vidro. Depois, toque suavemente o papel-filtro ao qual a retina está aderida sobre uma toalha de papel para remover o anel excessante. Mergulhe uma lâmina de barbear na solução de biotina neural e faça um corte radial perpendicular através da retina e do papel-filtro.Em seguida, mergulhe a lâmina de barbear novamente na solução de biotina neural e corte a retina uma segunda vez. Repita esse procedimento até quatro cortes por retina. Nesta etapa, transfira a retina para solução de Ringer fresca, com ou sem o fármaco em teste, durante 15 minutos para permitir o carregamento e a difusão.Lave-o três vezes com solução de Ringer fresca, meio com ou sem a droga em teste, durante cinco minutos cada. Em seguida, fixe a retina com paraformaldeído a 4% em solução tampão fosfato 0,1 molar, à temperatura ambiente, durante uma hora. Posteriormente, lave a retina com PBS 0,1 molar durante a noite a quatro graus Celsius, colocando-a em um refrigerador no dia seguinte.Incube a retina com streptavidina Alexa 488 a 2% em PBS 0,1 molar e Triton X-100 a 0,3% até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a retina três vezes com PBS 0,1 molar à temperatura ambiente, cada vez durante 10 minutos.Destaque a retina do papel filtro em PBS. Em seguida, utilizando um pincel fino, monte a retina com o lado dos fotorreceptores voltado para cima em uma lâmina com meio de montagem Vector Shield. Transfira a lâmina para um microscópio confocal de varredura a laser e capture imagens com a mesma resolução de aumento e configurações para todas as condições experimentais, de modo que possam ser feitas comparações dos efeitos de diferentes condições experimentais sobre a extensão do acoplamento por tracers funcionais de lacunas, conforme mostrado.Aqui está o grau de acoplamento do marcador de células fotorreceptoras durante o dia em escotopia constante em comparação com o dia em escotopia constante na presença de um antagonista seletivo do receptor de dopamina D dois. Observe que o corte com lâmina em ambas as imagens está à esquerda. Embora uma única imagem possa conter todas as células marcadas, recomenda-se coletar uma pilha Z da área de interesse e combiná-la em uma única imagem mostrada.Aqui está o grau de acoplamento do marcador de células fotorreceptoras ao se percorrer sequencialmente um Zack. Observe que o corte com lâmina nesta imagem está à direita. Para quantificar o grau de acoplamento do marcador no navegador de imagens LSM, abra a imagem, clique em exportar e salve a imagem como um arquivo TIF de 16 bits sem compressão; a escala deve ser incluída nesta imagem TIF utilizando o software NIH Image J.Meça a intensidade de fluorescência do neurobiotina marcado com Alexa 488 a partir de imagens de retina montada em orifício com baixa ampliação. Abra o arquivo TIFF usando o software ImageJ e, em seguida, desenhe uma linha reta correspondente à barra de escala. Em seguida, vá até analisar, defina a escala e insira a distância conhecida e a unidade de comprimento.Em seguida, clique em OK. Agora, as medições de fluorescência podem ser apresentadas em unidades calibradas, como milímetros. Após isso, selecione a área de interesse utilizando a ferramenta de seleção retangular.O pico da fluorescência deve ser posicionado na borda esquerda da sua seleção. Certifique-se de que não há sinal fluorescente próximo à borda direita. Clique em analisar e traçar o perfil para os dados de controle diurno obtidos em escuro constante.Uma curva com decaimento exponencial é exibida da esquerda para a direita. Em seguida, clique em copiar na janela pop-up e cole no Excel. Agora existem duas colunas, uma mostrando a distância a partir do corte e a outra mostrando a intensidade de fluorescência como função da distância a partir do corte.Como comparação, os passos acima são repetidos com dados obtidos em escuridão constante durante o dia. Na presença de spit bro, divida cada valor bruto de fluorescência pelo valor máximo de fluorescência para obter a intensidade relativa de fluorescência. Copie duas colunas correspondentes à distância do corte e à intensidade relativa de fluorescência, e então cole-as no software Origin.Esses passos são demonstrados tanto para o controle diurno quanto para a saliva diurna. Os dados obtidos neste ponto são ajustados aos resultados com a função de decaimento exponencial. Função número um: compare os valores da constante espacial em diferentes condições experimentais utilizando um teste T ou ANOVA.Funções exponenciais e análises estatísticas dos dados de controle diurno, piprona diurna e controle noturno são apresentadas para comparação. Aqui estão exemplos do grau de acoplamento de células fotorreceptoras marcadas com traçador na retina de peixe-dourado adaptada à escuridão durante o dia A, a noite B e durante o dia na presença de um antagonista seletivo do receptor de dopamina D2, conforme revelado pela técnica de carregamento por corte. Todas as imagens confocais foram obtidas usando as mesmas configurações para fins comparativos.Neste gráfico, a intensidade de fluorescência para três condições experimentais é representada em função da distância em relação ao corte e ajustada por uma função exponencial. A técnica de carregamento por corte é utilizada para quantificar o grau de acoplamento por marcadores nas junções do tipo gap, calculando-se os valores da constante espacial, conforme mostrado aqui para três condições experimentais. A técnica de carregamento por corte também pode ser usada para investigar as sinapses elétricas entre outros tipos celulares na retina e em outras espécies.Por exemplo, essas duas figuras ilustram que os neurônios horizontais do tipo A e do tipo B em coelhos exibem acoplamento homólogo por traçador após carga por corte e difusão de neurobiotina em condições de escotopia. Utilizamos a técnica de carga por corte para estudar o grau de difusão do traçador através das junções comunicantes entre bastonetes e cones durante o dia e a noite. Além disso, essa técnica pode ser usada para determinar se o acoplamento por traçador entre outros neurônios retinianos é controlado pelo relógio retiniano e/ou por condições específicas de luz e escuridão.Também pode ser utilizado para estudar o acoplamento de traçadores entre neurônios em outras regiões cerebrais.

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Nós descrevemos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de elevada concentração de corantes fluorescentes e de cálcio sensíveis em neurónios ou qualquer tracto neuronal, utilizando uma pipeta de sucção de polietileno.

Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

Este protocolo descreve uma técnica de transferência de bisturi de carga e corante fluorescente que mede comunicação intercelular através dos canais de junções de hiato. Gap comunicação intercelular juncional é um importante processo celular pelo qual a homeostase do tecido é mantido e ruptura dessa sinalização celular tem efeitos adversos para a saúde.

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

Aqui, descrevemos um método para carregar um corante sensível ao cálcio através do coto nervoso do sapo nas terminações nervosas. Também apresentamos um protocolo para a gravação e análise de transientes de cálcio rápidos nas terminações nervosas periféricas.

Carregando uma tintura de cálcio em terminação de nervo de sapo através do coto nervoso: Registro de transientes de cálcio na união neuromuscular de sapo

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de comunicação intercelular junção romance lacuna projetado para o rastreio da elevado-produção de químicos de junção-modulando de lacuna para descoberta de drogas e avaliação toxicológica.

Um ensaio de comunicação intercelular junção iodeto-amarelo fluorescente proteína-Gap

Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

Aprenda o método de cut-loading para avaliar o acoplamento por junções comunicantes entre neurônios da retina intacta usando neurobiotina como traçador. Esta técnica facilita o estudo de sinapses elétricas sob condições controladas de iluminação.

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

Explorar mais vídeos