Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

O objetivo geral do seguinte experimento de carga de corte é examinar a extensão do acoplamento do traçador de junções comunicantes entre neurônios na retina intacta sob condições de iluminação controladas. O primeiro passo é alcançado cortando retinas com uma lâmina afiada mergulhada em uma solução de neurobiotina, uma molécula traçadora que pode se difundir através de canais de junção gap abertos, mas não de membranas celulares. Na segunda etapa, as retinas são incubadas em solução de Ringer, que permite a difusão do traçador através de canais de junção gap abertos.

Se o acoplamento da junção comunicante for fraco, a fluorescência da neurobiotina será restrita aos neurônios da retina que estão próximos ao corte. Em contraste, se o acoplamento da junção comunicante for forte, a fluorescência será detectada nos neurônios da retina longe do corte. A principal vantagem da carga de corte em relação às técnicas existentes é que é mais fácil de executar em neurônios com pequenos corpos celulares em tecido neural retiniano intacto.

Também é mais fácil controlar as condições de iluminação durante a carga de corte do que durante um estudo eletrofisiológico de neurônios individuais em tecido retiniano intacto. Como os estímulos de luz usados durante a gravação elétrica podem levar a mudanças no acoplamento da junção comunicante, demonstrando a técnica estará o Dr. Chu Choi, um pós-doutorado do meu laboratório. Neste procedimento, um peixinho dourado é mantido em constante escuridão durante o dia por pelo menos uma hora antes da cirurgia, e todas as etapas seguintes até que o tecido da retina seja fixado, também são realizadas durante o dia em constante escuridão, anestesiar profundamente o peixinho dourado adicionando 150 miligramas por litro de sulfonato de metano à água do aquário.

Em seguida, sacrifique o peixinho dourado de acordo com as diretrizes federais e universitárias e remova seus globos oculares com cuidado. Em seguida, remova a porção anterior de cada globo ocular. Em seguida, coloque um pedaço de papel de filtro em cima da parte posterior do olho e inverta o papel de filtro e o olho de modo que o papel de filtro fique embaixo da parte posterior do olho.

Agora, remova suavemente a parte de trás do olho, incluindo a esclera e o epitélio pigmentar do peixinho dourado adaptado ao escuro. A retina cortou o nervo óptico com uma tesoura fina. O peixinho dourado neural, com o lado fotorreceptor orientado para a retina para cima, agora deve ser anexado ao papel de filtro antes da enucleação, enquanto o peixe está sendo anestesiado a cinco mililitros oxigenados por solução de ringer à base de carbonato com ou sem droga de teste em cada poço de uma placa de seis poços após a dissecção da retina neural intacta da porção posterior do olho.

Transfira as retinas para os poços durante a escuridão constante. Em seguida, sele os poços com paraforme e deixe o tecido incubar por 30 minutos. Prepare 100 microlitros de solução traçadora dissolvendo 0,5% de neurobiotina em solução de ringer imediatamente antes de cortar a retina.

Em seguida, adicione a solução de neurobiotina a uma placa de Petri de vidro. Em seguida, bata suavemente no papel de filtro ao qual a retina está presa em uma toalha de papel. Para remover o excesso de toques, mergulhe uma lâmina de barbear na solução de neurobiotina e faça um corte radial perpendicular na retina e no papel de filtro.

Depois disso, mergulhe a lâmina de barbear na solução de neurobiotina novamente e corte a retina uma segunda vez. Repita isso até quatro cortes por retina. Nesta etapa, transfira a retina para anéis frescos, meio com ou sem medicamento de teste por 15 minutos para permitir o carregamento e a difusão.

Lave-o três vezes com campainhas frescas, médias com ou sem medicamento de teste por cinco minutos cada. Em seguida, fixe a retina com formaldeído a 4% em solução tampão fosfato molar 0,1 molar em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, lave a retina com PBS 0,1 molar durante a noite a quatro graus Celsius, colocando-a na geladeira no dia seguinte.

Reaja a retina com 2% de estreptavidina Alexa 4 88 em 0,1 molar PBS e 0,3% Triton X 100 a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incubada durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte. Lave a retina três vezes com PBS 0,1 molar em temperatura ambiente a cada vez por 10 minutos.

Separe a retina do papel de filtro em PBS. Em seguida, usando um pincel fino, monte o lado do fotorreceptor da retina para cima em uma lâmina com meio de montagem de escudo vetorial. Transfira a lâmina para um microscópio confocal de varredura a laser e tire fotos com a mesma ampliação, resolução e configurações para cada condição experimental, de modo que as comparações dos efeitos de diferentes condições experimentais na extensão do acoplamento do traçador funcional da lacuna possam ser mostradas.

Aqui está a extensão do acoplamento do traçador de células fotorreceptoras durante o dia na escuridão constante em comparação com durante o dia na escuridão constante na presença de um antagonista seletivo dos dois receptores da dopamina D. Observe que o corte de navalha em ambas as imagens está à esquerda. Embora uma única imagem possa conter todas as células rotuladas, recomenda-se coletar uma pilha Z da área de interesse e recolhê-la em uma única imagem mostrada.

Aqui está a extensão do acoplamento do traçador de células fotorreceptoras à medida que se move sequencialmente através de tal Zack. Observe que o corte de navalha nesta imagem está à direita. Para quantificar a extensão do acoplamento do rastreador no navegador de imagens LSM, abra a imagem, clique em exportar e salve a imagem como uma barra de escala de arquivo não compactada TIF de 16 bits deve ser incluída nesta imagem TIFF usando o software NIH image J.

Meça a intensidade de fluorescência da neurobiotina marcada com Alexa 4 88 a partir de imagens de baixa ampliação de retinas de montagem em orifícios. Abra o arquivo TIFF usando o software Image J e desenhe uma linha reta correspondente à barra de escala. Em seguida, vá para analisar, defina a escala e insira a distância e a unidade de comprimento conhecidas.

Em seguida, clique em OK. Agora as medições de fluorescência podem ser apresentadas em unidades calibradas, como milímetros. Em seguida, selecione a área de interesse usando a ferramenta de seleção retangular.

O pico de fluorescente deve ser posicionado na borda esquerda de sua seleção. Certifique-se de que não haja sinal fluorescente perto da borda direita. Clique em analisar e plotar o perfil para os dados de controle diurno obtidos na escuridão constante.

Uma curva com um decaimento exponencial é exibida da esquerda para a direita. Em seguida, clique em copiar na janela pop-up e cole-o no Excel. Agora existem duas colunas, uma mostrando a distância do corte e a outra mostrando a intensidade da fluorescência em função da distância do corte.

Como comparação, as etapas acima são repetidas com dados obtidos na escuridão constante durante o dia. Na presença de cuspe bro, divida cada valor de fluorescência bruto pelo valor máximo de fluorescência para obter a intensidade relativa de fluorescência. Copie duas colunas correspondentes à distância do corte e à intensidade relativa da fluorescência e cole-as no software de origem.

Essas etapas são mostradas para o controle diurno e o cuspe diurno. Os dados de execução neste ponto se ajustam aos resultados com o decaimento exponencial. Função número um, comparar os valores da constante de espaço em diferentes condições experimentais usando um teste T ou Inova.

Funções exponenciais e análises estatísticas de dados de controle diurno, pip rone diurno e controle noturno são mostradas para comparação. Mostrado. Aqui estão exemplos da extensão do acoplamento do traçador de células fotorreceptoras na retina de peixinho dourado adaptada ao escuro no dia A, à noite B e durante o dia na presença de um antagonista seletivo de dois receptores de dopamina D, conforme revelado pela técnica de carregamento de corte. Todas as imagens confocais foram tiradas usando as mesmas configurações para comparação.

Neste gráfico, a intensidade de fluorescência para três condições experimentais é plotada em função da distância do corte e ajustada pela função exponencial. A técnica de carregamento de corte é usada para quantificar a extensão do acoplamento do traçador da junção da lacuna calculando valores de constante de espaço, conforme mostrado aqui para três condições experimentais. A técnica de carregamento de corte também pode ser usada para investigar as sinapses elétricas entre outros tipos de células na retina e em outras espécies.

Por exemplo, essas duas figuras ilustram que as células horizontais do coelho, do tipo A e do tipo B exibem acoplamento de traçador homólogo a seguir, carga de corte e difusão de neurobiotina sob condições adaptadas ao escuro. Usamos a técnica de carregamento de corte para estudar a extensão da difusão do traçador através das junções comunicantes entre bastonetes e cones durante o dia e a noite. Além disso, essa técnica pode ser usada para determinar se o acoplamento do traçador entre outros neurônios da retina é controlado pelo relógio da retina e/ou por condições específicas de luz escura.

Também pode ser usado para estudar o acoplamento do traçador entre neurônios em outras regiões do cérebro.