Name: Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Aprenda a expandir células T γδ de sangue periférico humano usando zoledronato e IL-2 para imunoterapia autóloga em câncer. Este método clínico permite obter células funcionais em grande escala.

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1. Isolamento de PBMC <ol><li> Coleta de sangue (7,5-8,0 ml) em um BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica. O tubo contém um anticoagulante heparina sódica e um fluido de densidade Ficoll-Hypaque, além de uma barreira de gel de poliéster, que separa os dois líquidos. Tubo de centrifugação / amostra de sangue em temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) em um rotor horizontal (swing out-cabeça) por 20 min a 1800 x g. Interruptor centrífuga freios off. </li><li> Após a centrifugação, a seqüência de camadas ocorre da seguinte forma (visto de cima para baixo): um plasma) - b) células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e plaquetas - c) solução de densidade - d) gel de poliéster - e) granulócitos - f) glóbulos vermelhos (Fig. 1). </li><li> Coletar uma fração da camada de plasma, deixando 5 a 10 mm de plasma acima da interfase sem perturbar a camada de células. O plasma pode ser usado para a cultura (seção 2.5). </li><li> Colheita da fração enriquecida (PBMC) na interfase com uma pipeta e transferir para um tubo de 15 ml. </li><li> Lave o PBMC com 10 ml de tampão fosfato (PBS), invertendo o tubo 5 vezes, e então centrifugar por 5 min a 400 x g. </li><li> Repita os passos de lavagem duas vezes, e, em seguida, ressuspender o sedimento celular em 5 ml de PBS. Determinar o número de células. Normalmente, 1,3 x10 6 células são recuperados a partir de 1 ml de sangue total. </li><li> Determinar a freqüência e fenótipo de células T γδ em PBMC por citometria de fluxo (seção 3) (Fig. 2). </li></ol> 2. Expansão de células T γδ <ol><li> Centrífuga suspensões de células em 15 ml tubos cônicos por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente, e descartar o sobrenadante. </li><li> Prepare meio de cultura (CM), acrescentando IL-2 humana (IL-2) e zoledronato (Zometa) para concentrações finais de 1000 UI / ml e 5 mM, respectivamente. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) ou Optmizer (Invitrogen) o suporte a expansão de células γδ boa T (mais informações em referências 6 e 9). Zometa é fornecido na forma líquida (4 frasco mg/5-ml). Para preparar uma solução de M 5, adicione 50 ul de Zometa para 30 ml de meio de cultura. </li><li> Ressuspender pellet celular em meio de cultura e ajustar a 1x10 6 células / ml. </li><li> Ml pipeta 1 de CM contendo 1x10 6 células em cada poço de uma placa de 24 poços. De grande escala culturas, as células podem ser semeados em 0,5 x 10 6 células / cm 2 de acordo com as áreas de superfície dos poços da placa, prato, ou balão. </li><li> Adicionar plasma autólogo (seção 1.3), agrupados humano AB soros, ou FCS para que seja aproximadamente 10% do volume da cultura (100 l para cada poço de uma placa de 24 poços). Coloque as placas em um umidificado 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 por 24-48 horas. </li><li> Manter a cultura, a uma densidade de células de 0,5-2 x 10 6 células / ml. Adicionar meio fresco contendo IL-2 humana (1000 UI / ml) apenas (sem Zometa) a cada 2-3 dias, ea transferência de células cultivadas em novos poços ou frascos, se necessário, de acordo com o grau de proliferação celular (Fig. 3). Fornecimento de plasma ou soro ao meio de modo que a concentração sérica pode ser mantida pelo menos 1%. </li><li> Células colheita no dia 14/12 e determinar a freqüência de fenótipo, e as funções de células T γδ por citometria de fluxo (veja abaixo). </li></ol> 3. Análise fenotípica por citometria de fluxo <ol><li> Transferência de 200 amostras l contendo 2 x 10 5 células para fluorescência-activated cell sorting (FACS) tubos. </li><li> Adicionar 2 ml de frio PBS e centrifugar por 5 min a 400 x g. Então, voltar a suspender as pelotas em 50 mL tampão FACS (PBS + 1% FCS azida de sódio + 0,1%). Adicionar 5 mL de cada anticorpos para as amostras (os anticorpos monoclonais estão listados na Tabela 1). </li><li> Incubar no gelo no escuro por 20 min. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão FACS para cada amostra, e depois de vórtice. Amostras de centrífuga por 5 min a 400 x g a 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 300 mL de buffer FACS e vortex. Analisar amostras em um citômetro de fluxo (Fig. 2). </li></ol> 4. IFN-γ ensaio de produção de 10 <ol><li> Um dia antes do ensaio, preparar células estimulador através da cultura 05/03 x10 5 células Daudi / ml em meio RPMI 1640, mais 10% SFB (RPMI-10) durante a noite com Zometa (5 mM) (doravante designado Z-Daudi). </li><li> Coletar Z-Daudi e ressuspender em RPMI-10 em 2x10 6 células / ml. Adicionar 100 ul de Z-Daudi (2x10 5) a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços. </li><li> Prepare γδ células T em 2x10 6 células / ml em RPMI-10 contendo Brefeldin A a 20 mg / ml. Transferência de 100 l da suspensão de células T γδ (2x10 5) a cada poço contendo Z-Daudi células ou para controlar poços (100 ul de RPMI-10 apenas, ou RPMI-10 com 20 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato[PMA] mais 2 mg / ml de ionomicina). </li><li> Mix pipetando cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 4 horas a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li><li> Centrifugar a placa por 5 min a 400 x g a 4 ° C e ressuspender o pellets em 200 mL de frio PBS. </li><li> Transferir as amostras para tubos FACS. Adicionar 4 ml de frio PBS e centrifugar os tubos por 5 min a 400 x g a 4 ° C. </li><li> Volte a suspender as pelotas em 50 ul de tampão FACS com FITC-conjugado anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 mL). Incube ao abrigo da luz por 15 min em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de IntraPrep reagente 1 e incubar por 15 min em temperatura ambiente. Adicionar 4 ml de PBS a cada tubo e centrifugar por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente. </li><li> Retire o sobrenadante por aspiração e adicione 100 ml de IntraPrep dois reagentes. Incubar por 5 min à temperatura ambiente sem agitação. </li><li> Adicionar 5 mL da PE-conjugado anti-IFN-γ mAb ao tubo de ensaio. Incube ao abrigo da luz por 15 min em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 ml de PBS a cada tubo e centrifugar por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet celular em 0,5 ml de tampão FACS. </li><li> Analisar as células por citometria de fluxo. Portão de CD3 + + TCRVγ9 células e examinar a expressão de IFN-γ (Fig. 4). </li></ol> 5. Resultados representativos: É importante para determinar a porcentagem de células T γδ em PBMC no início da cultura. Como mostrado na figura. 2 A, a porcentagem de células CD3 + + TCRVγ9 células T γδ em PBMC foi de 1,6% no dia 0. As populações dominantes eram CD27 + CD45RA + CD27 + ingênuo ou CD45RA - fenótipos de memória central. Quando as células T γδ foram eficientemente estimulados, eles formaram clusters no dia 05/03 (Fig. 3 A e B). Quando a formação do cluster foi adiada, o crescimento de outros tipos de células, tais como CD4 + ou CD8 + células T αβ ou células NK poderia dominar o crescimento de células T γδ (Fig. 3 C e D). Após 14 dias de cultura, a freqüência de células T γδ aumentou para mais de 93,8% das células cultivadas em culturas de células γδ sucesso T (Fig. 2 E). A cultura de células T γδ NKG2D upregulated CD69 e expressão (Fig. 2 G e H). Eles exibido CD27 - CD45RA - fenótipo de memória efetoras (Fig. 2 F). As funções das células T γδ foram avaliados em relação à produção de citocinas e citotoxicidade. IFN-γ o intracelular coloração demonstraram que as células T γδ IFN-γ produzido em resposta a PMA / ionomicina tratamento ou Z-Daudi células que IPP acumulado após o tratamento zoledronato (Fig. 4). Estes resultados indicam que zoledronato pode eficientemente estimular e expandir funcional das células T γδ. <table border="1"><tbody><tr><td> tubo </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> camundongo IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> camundongo IgG1 </td><td> camundongo IgG1 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Anticorpos monoclonais utilizados no multicolor de coloração de células T γδ. Um exemplo da análise fenotípica de células T γδ realizados em nosso laboratório é mostrada na figura. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Separação de PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) é desenhada em um BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica e directamente centrifugada por 20 min a 1800 x g. Após a centrifugação, as camadas, resultando como visto de cima para bottom: a Plasma) - b) PBMC e plaquetas - solução Densidade c) - d) gel de poliéster - e) Granulócitos - f) Os glóbulos vermelhos. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fenótipo de superfície típica de células T γδ. PBMC foram estimuladas com zoledronato e IL-2 por 14 dias. Células foram marcadas com FITC-rotuladas anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 para monitorar a expansão de células T γδ (A e E). As células T γδ foram identificados por sua expressão de TCRVγ9, e sua expressão de CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), ou CD69 (D e H) foi examinada. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante culturas de células T γδ. PBMC foram estimuladas com IL-2 (1.000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campos representativos são mostrados (IX71 microscópio invertido [Olympus] x 200). Aglomerados e agregados de células T γδ podem ser observados no dia 3 (A) e dia 5 (B), quando as células T γδ expansão com sucesso. Em contraste, não aglomerados ou agregados foram observados quando o crescimento das células T γδ não era adequado (C e D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. IFN γ-produção. As células T γδ foram incubadas com RPMI-10 apenas (A) ou PMA / ionomicina (B) ou Z-Daudi (C) por 4 horas. Em primeiro lugar, a expressão de superfície de TCRVγ9 estava manchada e IFN-γ, em seguida, a produção foi examinado por intracelular IFN-γ coloração. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cinética da cultura de células T γδ. (A) o número absoluto de células em cultura, (B) porcentagem de células T γδ, e (C) número absoluto de células T γδ nos pontos de tempo indicado.

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<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite a expansão eficiente de células T γδ do PBMC. células γδ T ativadas e se expandiu por zoledronato e IL-2 completa desenvolver funções efetoras, refletido pela produção de citocinas e citotoxicidade. Tem sido relatado que o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) também expandir as células T γδ, no entanto, eles não estão disponíveis comercialmente. Em contraste, zoledronato já está licenciado para aplicações clínicas como Zo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zoledronato </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> IL-2 recombinante humana </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 médio </td><td> Cell Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> Optmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> A brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomicina </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ml </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD3 humano-FITC ou PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD4-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD19 humano-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD45 humano-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano TCRαβ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano TCR Vγ9-FITC </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD45RA-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD69 humano-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNγ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Isotipo IgG1-PE controle </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Isotipo IgG1 controle-ECD ou PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansão do sangue periférico humano γδ células t usando zoledronato

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Células T γδ podem reconhecer e responder a uma grande variedade de estresse induzido por antígenos, desenvolvendo assim uma atividade ampla inata anti-tumorais e anti-infecciosos. 1 A maioria das células T γδ no sangue periférico tem o Vγ9Vδ2 receptor de células T. Estas células reconhecem o antígeno em um principal de histocompatibilidade forma complexa independente e desenvolver forte citolítica e Th1-like funções efetoras. 1 Portanto, as células T γδ são células efetoras candidato atraente para a imunoterapia do câncer. Vγ9Vδ2 células T responder a phosphoantigens tais como (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enilo pirofosfato (HMBPP), que é sintetizada em bactérias através de biossíntese de isoprenóides; 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), que é produzido em células eucarióticas através da via mevalonato. 3 Na condição fisiológica, a geração de IPP na célula nontransformed não é suficiente para a ativação de células T γδ. Desregulação da via mevalonato em células tumorais leva ao acúmulo de IPP e γδ T ativação das células. 3 Porque aminobisphosphonates (tais como o pamidronato ou zoledronato) inibem sintase farnesil pirofosfato (FPP), a enzima agir a jusante do IPP na via mevalonato, níveis intracelulares de IPP e sensitibity para γδ reconhecimento células T pode ser terapeuticamente aumentou aminobisphosphonates. IPP acumulação é menos eficiente nas células nontransfomred de células tumorais com uma concentração farmacologicamente relevantes da aminobisphosphonates, que nos permitem imunoterapia para o câncer, ativando as células T γδ com aminobisphosphonates. 4 Curiosamente, IPP acumula em monócitos quando PBMC são tratados com aminobisphosphonates, por causa do eficiente absorção de drogas por essas células. 5 monócitos que se acumulam IPP se tornar células apresentadoras de antígenos e estimular Vγ9Vδ2 células T no sangue periférico. 6 Com base nesses mecanismos, nós desenvolvemos uma técnica de expansão em grande escala de culturas de células T γδ usando zoledronato e interleucina -2 (IL-2). 7 Outros métodos para a expansão de células T γδ utilizar o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) 8 ou 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP). 9 Todos estes métodos permitem que ex vivo de expansão, resultando em um grande número de células T γδ para uso em imunoterapia adotiva. No entanto, apenas zoledronato é um reagente FDA-approved disponíveis comercialmente. Zoledronato-expandida de células T γδ mostrar CD27 - CD45RA - fenótipo de memória efetoras e sua função pode ser avaliada por IFN-γ ensaio de produção 7.

Um método para expandir células T γδ a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) é descrito. PBMC células derivadas de T γδ são estimuladas e expandida usando zoledronato e interleucina-2 (IL-2). Expansão em grande escala de células T γδ podem ser aplicadas a imunoterapia celular autóloga de câncer.

Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

As células T $\gamma\delta$ humanas podem reconhecer e responder a uma ampla variedade de antígenos induzidos por estresse, desenvolvendo, assim, uma resposta antitumoral inata abrangente e...

Este vídeo demonstra a expansão em larga escala de células T gama delta do sangue periférico humano utilizando zoledronato. Primeiro, o sangue total é submetido à centrifugação em gradiente de densidade para isolar as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs. As PBMCs são estimuladas com zoledronato para induzir a transformação de monócitos em células apresentadoras de antígenos, e também com IL-2 para estimular as células T gama delta.As células são incubadas por até 14 dias para proliferar linfócitos T gama delta. A análise do cultivo por citometria de fluxo demonstra que a maioria das células colhidas exibe fenótipo CD3 positivo Vγ9 positivo. A principal vantagem desta técnica em relação ao método existente é que o agente já está licenciado para aplicações clínicas com Zometa.Portanto, um reagente confiável está facilmente disponível para o preparo clínico de células T gama delta, demonstrando que o procedimento será cultura celular makoto condo e amichi izumi. Técnicos do meu laboratório iniciam este procedimento isolando células mononucleares do sangue periférico a partir de sangue total coletado em um tubo BD vacutainer CPT para preparação de células contendo anticoagulante heparina sódica e um líquido de alta densidade fial, além de uma barreira de gel de poliéster, que separa os dois líquidos. Centrifugue a amostra à temperatura ambiente em rotor de braço oscilante por 20 minutos a 1800 vezes G. Após a centrifugação, o conteúdo do tubo será separado em cinco camadas.A camada superior amarela consiste em plasma. Abaixo dessa, uma camada esbranquiçada contém células mononucleares do sangue periférico e plaquetas, que se situam acima da solução de densidade amarelo-claro. Uma camada de gel de poliéster na cor branca separa esta das camadas granulares, que formam uma camada acinzentada situada acima das hemácias no fundo do tubo.Usando uma pipeta de dois mililitros, colete cuidadosamente uma fração da camada de plasma, deixando de cinco a dez milímetros de plasma acima da interface, e transfira-a para um tubo cônico de 15 mililitros. Coloque o tubo a quatro graus Celsius para utilização em cultura. Em seguida, use uma pipeta de dois mililitros para colher a fração enriquecida em PBMCs na interface e transfira-a para um tubo cônico de 15 mililitros.Para lavar os PBMC, adicione 10 mililitros de PBS e inverta o tubo cinco vezes. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos a 400 vezes G. Repita os passos de lavagem duas vezes. Depois de ressuspender o pellet celular em cinco mililitros de PBS, utilize um hemocitômetro para determinar o número de células.Normalmente, recuperam-se 1,3 vezes 10 à sexta células a partir de um mililitro de sangue total. Uma fração de pbmc contendo um vezes 10 à sexta células é separada e mantida em gelo para análise por citometria de fluxo.Para expandir as células T gama delta na amostra de PBMC, centrifugue as suspensões celulares em tubos cónicos de 15 mililitros durante cinco minutos a 400 vezes G, à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes e ressuspenda as células em meio de cultura celular, suplementado com 1000 UI por mililitro de IL-2 e 5 micromolares de zoledronato, numa densidade de 1 × 10⁶ células por mililitro. O zoledronato inibe a fosfossintase do faril pirofosfato em monócitos, levando ao acúmulo de pirofosfato de isopentenil e à conversão dos monócitos em células apresentadoras de antígenos.Em seguida, pipete um mililitro de meio contendo um vezes 10 à sexta células para cada poço de uma placa de 24 poços. As células devem estar a 0,5 vezes 10 à sexta por centímetro quadrado. Assim, para culturas maiores, ajuste proporcionalmente para cada poço de uma placa de 24 poços.Adicione 100 microlitros do plasma autólogo coletado anteriormente, soro humano AB em pool ou soro bovino fetal. Coloque as placas em uma estufa umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono a cada dois ou três dias. Substitua o meio por meio fresco suplementado com soro contendo 1000 UI por mililitro de IL-2 humano.Quando as células atingirem uma densidade de 0,5 a 2 × 10⁶ células por mililitro, divida-as na proporção de 1:2 em novas placas ou frascos. Observe as células ao longo de vários dias. Aqui são mostradas as células no dia zero.As células menores são linfócitos. As células maiores são monócitos. Cerca de 24 horas depois, os monócitos aderem ao fundo do poço.Após dois dias, alguns linfócitos aderem aos monócitos em três dias, e as células T gama delta começam a formar agregados. Em cinco dias, podem ser observados grandes agregados celulares. Em contraste, nenhum agregado ou聚簇 será observado quando o crescimento das células T gama delta não for adequado. Quando a formação de agregados for retardada.Como mostrado aqui, o crescimento de outros tipos celulares, como linfócitos T alfa beta CD4 positivos ou CD8 positivos ou células NK, domina o crescimento dos linfócitos T gama delta. No dia 12 a 14, pipete extensivamente as células com pipeta de 10 mililitros e colete as células em tubos cónicos de 50 mililitros. As células podem agora ser analisadas por citometria de fluxo para determinar a frequência, fenótipo e funções dos linfócitos T gama delta.Para realizar a análise fenotípica de PBMCs ou células T gama delta expandidas, comece transferindo amostras de 200 microlitros contendo duas vezes 10 à quinta células para cada um dos nove tubos de triagem celular ativada por fluorescência. Adicione dois mililitros de PBS frio e centrifugue por cinco minutos a 400 vezes G, em seguida, reconstitua os pellets em 50 microlitros. Adicione cinco microlitros de cada um dos anticorpos necessários às amostras.Incube as amostras em gelo, no escuro, por 20 minutos. Após a incubação, adicione dois mililitros do tampão fax a cada amostra e, em seguida, vortexe e centrifugue as amostras por cinco minutos a 400 ×g a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, despreze cuidadosamente o sobrenadante, re-suspenda as células em 300 microlitros do tampão fax e vortexe.Em seguida, analise as amostras em um citômetro de fluxo para avaliar a função das células T gama-delta. Sua capacidade de produzir interferon gama é analisada por coloração intracelular de interferon gama. Reconstitua as células T gama-delta em duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro em RPMI 10 contendo felden A a 20 microgramas por mililitro.Felden A inibe a secreção de interferon gama, resultando no acúmulo de interferon gama na célula. Em seguida, transfira 100 microlitros de suspensão de células T gama delta para cada poço de uma placa de 96 poços contendo apenas 100 microlitros de RPMI 10 ou RPMI 10 com 20 nanogramas por mililitro de four. Ball 12 ate 13 acetate mais 2 microgramas por mililitro de ionomicina ou células Z duddy.Agite pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incube por quatro horas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugue a placa por cinco minutos a 400 ×g a quatro graus Celsius após a ressuspenduição, ressuspendendo os pellets em 200 microlitros de PBS frio.Transfira as amostras para tubos fax. Em seguida, adicione quatro mililitros de PBS frio e centrifugue os tubos por cinco minutos a 400 ×g a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, re-suspenda os pellets em 50 microlitros de tampão fax com cinco microlitros.Incubar por 15 minutos, em temperatura ambiente e protegido da luz, com 2,5 microlitros de anticorpo monoclonal anti-CD3 conjugado com PE SCI cinco e anti-TCRV gamma nove conjugado com FE. Após a incubação, adicionar 100 microlitros do reagente intra prep um e incubar por 15 minutos. Em temperatura ambiente, adicionar quatro mililitros de PBS a cada tubo e centrifugar por cinco minutos a 400 vezes G; após a centrifugação, ressuspender o pellet em 100 microlitros do reagente intra prep dois e incubar por cinco minutos.À temperatura ambiente, adicione cinco microlitros de anticorpo monoclonal anti-gama interferon conjugado com PE ao tubo de ensaio. Incube protegido da luz por 15 minutos. À temperatura ambiente, adicione quatro mililitros de PBS a cada tubo e centrifugue por cinco minutos a 400 vezes G. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda o pellet celular.Em 0,5 mililitros de tampão fax. Analise as células por citômetro de fluxo, fazendo o gate em células TCR v gamma nove positivas e CD três positivas, e examine a expressão de interferon gama. O fenótipo superficial típico de células T gama delta é demonstrado conforme mostrado aqui.As células T gama delta foram identificadas pela sua expressão de CD três e TCRV gama nove no dia zero. A porcentagem de células T gama delta positivas para CD três e positivas para TCRV gama nove em PBMC foi de 1,6%. As populações predominantes de células T gama delta eram positivas para CD 27, positivas para CD 45 RA, com fenótipo de células naïve, ou positivas para CD 27, negativas para CD 45 RA, com fenótipo de memória central. As expressões de CD 27 e CD 45 RA são utilizadas para determinar seu fenótipo naïve ou de memória.CD27 positivo. CD45. RA positivo é ingênuo.CD27 positivo. CD45RA negativo é memória central CD27 negativo. CD45.RA negativo é memória efetora. CD27 negativo. CD45.RA positivo é um fenótipo diferenciado terminalmente. O estado de ativação das células foi analisado por meio de NK G 2D ou CD 69, conforme mostrado aqui. As células T gama delta expressam NK G 2D, mas não expressam CD 69.Após 14 dias de cultivo, a frequência de células T gama delta aumentou para mais de 93,8% das células cultivadas. Em cultivos bem-sucedidos de células T gama delta, elas exibiam fenótipo de memória efetora CD27 negativo e CD45RA negativo. As células T gama delta cultivadas aumentaram a expressão de NKG2D e CD69.A coloração intracelular para interferon gama demonstrou que as células T gama delta produziram interferon gama em resposta ao tratamento com PMA CIN ou às células Z dwy que acumularam IPP. Após o tratamento com zoledronato, 97% e 19,6% das células T gama delta produziram interferon gama em resposta à estimulação com PMA CIN e com células Z ddy, respectivamente. Esses resultados indicam que o zoledronato pode eficientemente estimular e expandir células T gama delta funcionais.A cinética da cultura de células T gama delta expandidas por zoledronato e IL-2 mostrou aumento exponencial no número absoluto de células cultivadas até os dias 12 a 14. O enriquecimento de células T gama delta foi alcançado relativamente cedo. Quase 80% das células cultivadas eram células T gama delta no sétimo dia. O número absoluto de células T gama delta nos pontos de tempo indicados demonstra que aproximadamente 2,2 × 10⁸ células T gama delta podem ser obtidas a partir de 1 × 10⁶ PPMC contendo 1,6 × 10⁴ células T gama delta após seu desenvolvimento.Essa técnica abre caminho para que pesquisadores na área da imunoterapia do câncer explorem aplicações clínicas em muitos tipos diferentes de câncer. Esse método de cultivo tem sido utilizado em ensaios clínicos de fase um, avaliando a segurança e viabilidade da terapia de transferência de linfócitos T gama-delta expandidos a partir de doadores em pacientes com câncer.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas

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Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

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Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

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A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

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Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Os osteoclastos são células-chave de reabsorção óssea no corpo. Este protocolo descreve um método confiável para a diferenciação in vitro de osteoclastos de monócitos de sangue periférico humano. Este método pode ser utilizado como uma importante ferramenta para o entendimento da biologia dos osteoclastos na homeostase e nas doenças.

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Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

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