Name: Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco hepáticas CD133+ de fígado murino para expansão clonal. Este método utiliza digestão tecidual, separação magnética de CD45 e citometria de fluxo, permitindo análise funcional detalhada.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Rountree reconhece o actual apoio da Rede das Crianças Miracle, National Institute of Health, K08DK080928 e R03DK088013, ea American Cancer Society Award Scholar Research, MGO-11651. Dr. Rountree reconhece que este processo foi inicialmente desenvolvido e refinado, enquanto financiado pelo Programa Pediátrica Scientist Desenvolvimento (NICHD Grant Award K12-HD00850).

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+%28TGF%29-beta-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology%3A+niche%2C+quiescence%2C+self-renewal%2C+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li>
<li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li>
<li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li>
<li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li>
<li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li>
<li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li>
<li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor%2Fstem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li>
<li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
<li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
<li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li>
<li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li>
<li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Dr. Rountree recebe apoio de pesquisa da Bayer Farmacêutica. Drs. Ding e Crooks e Ms. Dang e Ms. Vankirk não têm divulgações para relatar.

Ao contrário do sistema hematopoético, em que as células-tronco hematopoiéticas são responsáveis ​​por manter um sistema de diferenciação celular que replacesnormal fisiológicas turn-over de leucócitos, glóbulos vermelhos e plaquetas, células-tronco do fígado, ou células progenitoras adultas fígado, não participam de fígado normal homeostase. 5,6 Após lesão hepática aguda ou hepatectomia parcial, hepatócitos, epitélio como fígado diferenciados, passam por várias fases de proliferação para substituir a massa hepática perdido. 5,6 Somente durante lesão crônica são células-tronco do fígado observada a proliferar. 1,5 -11 Estes adultos, órgão células-tronco específicas são propostas para diferenciar-se em ambos os hepatócitos e cholangiocytes. 1,5-8 Curiosamente, a grande maioria de câncer de fígado desenvolve no fundo da lesão crônica, e, assim, as células-tronco do fígado também são hipótese a ser os precursores de um subconjunto de câncer de fígado. 2-4,12-17 Um dos grandes desafios para conter o trabalho celular no fígado é o isolamento de populações raras de células para análise funcional. Por exemplo, a grande maioria das células do fígado são hepatócitos, que são significativamente maiores do que cholangiocytes e outros menores não-parenquimatosa células. Quebrando todo o fígado em compartimentos celulares (hepatócitos grande - fração de parênquima e células menores - não-parenquimatosa fração), e ainda a seleção de células CD45 negativo (não-hematopoiéticas células), somos capazes de enriquecer a população a partir de células-tronco por mais de 600 vezes. 1,18-21 De notar que estamos de maneira nenhuma o que indica que a população + CD133 é um 100% da população de células-tronco pura, mas representa claramente uma população heterogênea de células, com diferentes linhagens e potencial de repovoamento. Uma das principais limitações do campo é definições de células-tronco e células progenitoras. Nós usamos a &quot;célula-tronco&quot; termo mais amplamente neste trabalho, mas em definição estrita, CD133 + não-parenquimatosa células representam uma população progenitora bi-linhagem. Dado o estado atual da haste e pesquisa de células progenitoras no fígado, este relatório não fornece um ponto de partida para os investigadores que estão interessados ​​neste campo. Como marcadores surgem novos, como EpCAM, 22,23 ou fatores de transcrição, tais como Sox9, 24 podem ser incorporados. Por exemplo, nós encontramos uma taxa bastante alta de sobreposição entre células EpCAM + e células CD133 +. Neste relatório, detalhamos um processo para isolamento de células-tronco do fígado de camundongos normais, bem como modelos de lesão crônica no fígado, que demonstram um aumento da proliferação de células-tronco do fígado. Este método tem vantagens claras sobre imuno-histoquímica padrão de congelados ou formol fígado fixado como estudos funcionais utilizando células vivas podem ser realizadas após o isolamento. 1,3,4 O objetivo específico deste processo é isolar uma população relativamente pura de células tronco do fígado que pode clonalmente ser expandidas in vitro. A principal limitação para este procedimento é que a maioria das células isoladas não será viável após a citometria de fluxo (ver secção Resolução de Problemas). Este é o resultado de as horas necessárias para preparar as células, e os inúmeros procedimentos necessários para refinar a população antes de isolamento. Se o fígado é digerido em suspensão única célula para análise FACS imediato, a diferença de tamanho entre os hepatócitos e outras células não-parenquimatosas fará criação portão eficaz FACS impossível. Se o fígado não-parenquimatosa células são utilizadas, sem eliminação de células hematopoiéticas, há um risco de que um número significativo de células CD133 + pode ser de origem hematopoiéticas podem contaminar a fração. Além disso, através do processamento das células através do filtro Miltenyi, apenas uma única célula e clusters muito pequena de células são coletadas. Isso garante que a amostra não vai entupir a agulha ingestão FACS. Alternativas para este procedimento incluem a modificação de qualquer marcador alternativa da superfície celular, tais como CD49f, EpCAM, ou a combinação de marcadores, como CD133 + + EpCAM Um segundo relatório publicado utiliza um gradiente de densidade para isolar células-tronco do fígado de uma fração não-parenquimatosas. Este procedimento requer uma centrífuga Ultra-(8000 xg), acrescenta um tempo significativo para o procedimento, e em nossa experiência, reduziu significativamente o rendimento pré-FACS celular e pós-FACS viabilidade 8. Experimentos futuros incluem uma ampla gama de análise de expressão gênica, incluindo genes do fígado fetal, tais como HNF3, HNF4α, e além αfp.In, análise de Western blot e imunocitoquímica das proteínas expressas podem ser utilizados para confirmar a RT-PCR, os resultados de células em cultura. Uma questão a se notar é um trabalho recente que identificou CD133 expressão em células estreladas hepáticas. 25 Nós agora rotineiramente tela nossas amostras para os marcadores de células estreladas (ver secção Resolução de Problemas), e não identified contaminação significativa no nosso frações. Isso pode estar relacionado com as diferentes técnicas de digestão do fígado e do isolamento de células. 2,3,26 Baseado no fato de que a maioria das células não vai ser viável imediatamente após o isolamento FACS, recomendamos que as células sejam banhados, seja como massa CD133 + células ou células isoladas, antes da sua utilização em animais. 5-7 dias in vitro irá melhorar significativamente os resultados da análise do tumor. Além disso, dado os rigores de isolamento única célula, este deverá ser realizado apenas uma vez colônias pode ser expandida a partir de CD133 + granel células isoladas. Uma discussão mais aprofundada das condições de cultivo e várias proteínas de andaime que podem ser utilizadas para conter a cultura do fígado e células progenitoras foi bem caracterizada por Lola Reid. Este trabalho oferece condições alternativas e modificações, que os investigadores podem incorporar em seu programa de pesquisa uma vez que técnicas de isolamento básicos são dominados. 27,28 Dr. Trabalho de Reid também fornece uma análise mais detalhada da biologia linhagem e maturação entre as células-tronco e progenitores hepática comprometida. Em termos de análise de tumor in vivo, temos tido sucesso usando recém células isoladas e células de expansão clonal CD133 + células in vitro, usando principalmente 1x10 6 células. Nós nos concentramos cepas ontwo genética de lesão hepática crônica, a MAT1a - / - e PTEN específica do fígado - / - ratos, e nós utilizamos camundongos nude e camundongos selvagens como hospedeiros de crescimento do tumor. Em nossa experiência, CD133 + células-tronco do fígado só vai formar tumores se eles são isolados a partir de modelos hepática significativa lesão que são pré-malignas. Note-se que os tumores formados a partir de células CD133 + geral têm tanto carcinoma hepatocelular e características colangiocarcinoma, sugerindo uma célula-tronco ou células progenitoras origem aos tumores. 2-4,29 Trabalho de acompanhamento após tumores são documentados inclui a análise patológica padrão de tecido tumoral (coloração H &amp; E) e coloração imuno-histoquímica. Além disso, os tumores podem ser picadas e digeridas para FACS análise ou re-cultura. 2-4,30 Em conclusão, temos um procedimento detalhado para o isolamento, expansão e caracterização básica de CD133 + células tronco do fígado e CD133 + células-tronco cancerosas. Resolução de Problemas: CD45 contaminação: Para o Passo 3, se houver contaminação do CD45 células +, que pode ser avaliado pela adição de um Ab CD45-FITC antes FACS análise e isolamento, verifique se o anticorpo microbead CD45 não expirou e que o filtrado foi coletado somente enquanto o filtro foi no suporte magnético. Qualquer filtrado recolhido enquanto que o filtro não está no suporte magnético irá conter células CD45 +. Número de células de baixa: Para o fígado sem ferimentos, o número total de CD133 + não-parenquimatoso isolado pode ser inferior a 10.000. Estas células são raras no fígado quiescente. Para um modelo de lesão crônica, tais como a dieta DDC 0,1%, o número irá aumentar enormemente a 100.000 células. Se o número total de células é significativamente abaixo desses números, uma questão a considerar é o FACS coloração Ab. Verifique para garantir que o Ab CD133 não expirou, como coloração pobres irá resultar em um rendimento pobre. Além disso, recomendamos realizar uma análise FACS do fígado não-parenquimatosa células para determinar a população relativa antes de tentar o isolamento FACS. Viabilidade celular baixa após FACS: Uma das questões de viabilidade pode ser relacionado à forma como as células são processadas e sobre o que o tempo. Idealmente, todo o procedimento de isolamento de células, os passos 1-4, deve ser realizada sem atrasos entre as etapas e concluída no mesmo dia. Qualquer atraso significativo entre os passos 1-4 irá reduzir significativamente a viabilidade celular. Uma segunda questão relacionada com a viabilidade das células podem estar relacionados à pressão bainha utilizado para o isolamento FACS. Recomendamos a utilização de uma menor pressão bainha. Por último, uma vez que as células são isoladas, elas devem ser imediatamente banhado, como qualquer armazenamento significativo no gelo após a triagem também irá reduzir sua viabilidade. CD133 + não-parenquimatosa heterogeneidade: Relatórios recentes indicam que as células estreladas hepáticas também podem ter CD133 expressão e ter alguma plasticidade. 25 Por isso, além de verificar a potência bi-genes com albumina e Krt19, verificação adicional pode incluir genes associados com as células estreladas, como a proteína fibrilar glial ácida em células estreladas quiescentes e alfa-actina de músculo liso e desmina em células estreladas ativadas. 3,4,26 Além disso, a população CD133 + representa uma população mais ampla progenitor. A adição de um segundo marcador, como EpCAM, pode ajudar a refinar ainda mais a população, e heterogeneidade limite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Com vermelho de fenol </td></tr><tr><td> CD45 microesferas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento do hepatócito </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento Epidérmico </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 grama </td></tr><tr><td> Colagenase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron filtro de malha </td><td> Pescador </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 reações </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi coluna LD </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Placas revestidas laminina </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 poços </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA 0,05% </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 colunas de 5x10 5 células ou menos </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> Concentração 10X </td></tr></tbody></table>

isolamento de cd133 + células tronco do fígado de expansão clonal

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Células-tronco do fígado, ou células ovais, proliferam durante a lesão hepática crônica, e são propostas para se diferenciar em ambos os hepatócitos e cholangiocytes. Além disso, as células-tronco do fígado são a hipótese de ser os precursores de um subconjunto de câncer de fígado, carcinoma hepatocelular. Um dos principais desafios para conter trabalho em células de qualquer órgão sólido como o fígado é o isolamento de uma população rara de células para análise detalhada. Por exemplo, a grande maioria das células do fígado são hepatócitos (fração parenquimatosa), que são significativamente maiores do que os não-parenquimatosa células. Através do enriquecimento das compartimentos específicos celulares do fígado (ou seja, parenquimatosas e não parenquimatosas frações), e selecionando para CD45 células negativas, somos capazes de enriquecer a população a partir de células-tronco por mais de 600 fold.The proceduresdetailed neste relatório permitem uma população relativamente raro de células de um órgão sólido a ser classificado de forma eficiente. Este processo pode ser utilizado para as células-tronco do fígado murino isolateliver normal, assim como modelos de lesão crônica no fígado, que demonstram um aumento da proliferação de células-tronco do fígado. Este método tem vantagens claras sobre imuno-histoquímica padrão de congelados ou formol fígado fixado como estudos funcionais utilizando células vivas podem ser realizadas após a primeira co-localização experimentos. Para realizar o procedimento descrito neste relatório, uma relação de trabalho com uma pesquisa do núcleo de citometria de fluxo baseado é fortemente encorajado, como os detalhes de isolamento FACS são altamente dependentes de instrumentos especializados e um forte conhecimento de básico citometria de fluxo dos procedimentos. O objetivo específico deste processo é isolar uma população de células-tronco do fígado que pode ser expandida clonal in vitro.

Aqui nós descrevemos o isolamento de células do fígado CD133 expressando-tronco e células-tronco do câncer de fígado murino todo, um processo que requer a digestão dos tecidos, o enriquecimento de células eo isolamento de citometria de fluxo. Nós incluem métodos para o isolamento de células avançado única e expansão clonal.

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Células-tronco hepáticas, ou células ovais, proliferam durante a lesão hepática crônica e propõe-se que se diferenciem tanto em hepatócitos quanto em colangiócitos. Em ...

Este vídeo demonstra um procedimento para o isolamento de células-tronco hepáticas com o objetivo de estudar a expansão clonal utilizando a expressão da superfície celular CD133 após lesão hepática crônica. Primeiramente, o fígado é removido de um camundongo com lesão hepática crônica e digerido para produzir uma suspensão de células únicas. Em seguida, é adicionado tampão de lise de hemácias para remover os glóbulos vermelhos, e a solução é aplicada em uma coluna magnética contendo anticorpo CD45 para remover os leucócitos CD45.As células com depleção de CD45 são então classificadas para enriquecer as células-tronco hepáticas positivas para CD133. As células-tronco hepáticas positivas para CD133 finalmente isoladas são cultivadas e expandidas. A análise in vitro da expressão gênica e proteica demonstra que as células-tronco positivas para CD133 isoladas são capazes de se diferenciar em hepatócitos e osteócitos.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a colocalização de marcadores usando técnicas de imunohistoquímica, é que células individuais podem ser isoladas para expansão clonal e análise funcional. Para confirmar os fenótipos de células-tronco e células progenitoras, a demonstração da técnica será realizada por mim e por He Dang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Prepare todos os tampões no meio 24 horas antes e armazene-os a quatro graus Celsius até o uso de todas as soluções.Os meios, instrumentos, filtros e tubos devem ser estéreis e manipulados com técnica estéril. Para reduzir o risco de contaminação, limpe a área abdominal de um camundongo eutanasiado com etanol a 70%. Usando instrumentos estéreis, abra a cavidade abdominal e exponha o fígado sobre um bloco.Remova a vesícula biliar do fígado transplantado, em seguida transfira o fígado inteiro para uma cabine de fluxo laminar em um recipiente estéril fechado, use uma lâmina de barbear estéril para picar o fígado com uma combinação de múltiplos cortes horizontais e verticais. Por um minuto, divida o fígado picado em quatro partes e coloque cada parte em um tubo de 15 mililitros com 10 mililitros de solução enzimática de digestão. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 45 minutos em um agitador ajustado para um a dois ciclos por segundo.Após a incubação, limpe os tubos com etanol 70%. Em seguida, sob uma capela de fluxo laminar, pipete a polpa hepática digerida através de uma peneira de malha de 70 microns e colete o filtrado em uma placa estéril para remover a fração parenquimatosa, que contém os hepatócitos maiores. Enxágue o filtro com alíquotas de dois mililitros de meio D-M-E-M-F 12 suplementado estéril.Use a extremidade de borracha do êmbolo de uma seringa para espremer a polpa digerida através do filtro. Repita este processo cinco vezes para obter um volume total de aproximadamente 20 mililitros. Divida o filtrado em dois tubos de 15 mililitros, iguais, e, em seguida, centrifugue a 50 vezes G durante um minuto a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um tubo rotulado como sobrenadante número um e descarte o pellet parenquimatoso. Em seguida, para coletar a fração não parenquimatosa, que contém as células-tronco e progenitoras, centrifugue o sobrenadante número um a 50 × g durante um minuto.Transfira o sobrenadante para um tubo rotulado como sobrenadante número dois e descarte novamente o pellet. Em seguida, centrifugue o sobrenadante número dois a 50 ×g durante um minuto.Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um tubo rotulado como sobrenadante número três e descarte o pellet. Por fim, centrifugue o SNAT final número três a 180 × g durante oito minutos para obter a fração não parenquimatosa; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e prossiga imediatamente para a próxima etapa do protocolo, na qual as células vermelhas e o pellet são lisadas. O tampão para lise de células vermelhas e o tampão Milli-Tene utilizados nesta parte do procedimento devem ter sido preparados na noite anterior e armazenados a quatro graus Celsius, conforme as instruções no documento escrito anexo.Trabalhando em uma cabine de fluxo laminar com as células e soluções sobre gelo, ressuspenda o pellet não parenquimatoso do passo anterior em um mililitro de tampão de lise de hemácias diluído 1x e transfira-o para um tubo de cinco mililitros. Tampe o tubo e vortexe suavemente por cinco segundos.Incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius. Proteger da luz após o período de 15 minutos. Centrifugar o tubo a 200 × g durante cinco minutos; após a centrifugação, descartar o sobrenadante, que contém hemácias lisadas e ressuspensão.Suspenda o pellet em um mililitro de tampão e gelo, frio e estéril. Centrifugue a 200 × g durante cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenatante e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão gelado e estéril.Tampão Milton e. Em seguida, remova 10 microlitros dessa suspensão celular e adicione 10 microlitros de azul de tripano. Conte as células não parenquimatosas utilizando um hemocitômetro para realizar o esgotamento de células hematopoiéticas CD45 da fração não parenquimatosa.Inicie na cabine de fluxo laminar ajustando a concentração das células para 10 à sétima até 10 à oitava. Células totais em 100 microlitros de tampão melty. Certifique-se de manter as células e os tampões frios durante todo o procedimento.Em seguida, adicione 20 microlitros de tampão mil, qualquer anticorpo de microesferas CD45 por 10 milhões de células e incube a quatro graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, adicione dois mililitros adicionais de tampão mil, qualquer tampão e centrifugue a 200 × g por cinco minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e reconstitua até 10⁸ células em um mililitro.Na cabine de fluxo laminar, coloque um tampão qualquer e uma coluna magnética LD em um suporte magnético. Posicione um tubo estéril de cinco mililitros abaixo do filtro para coletar o filtrado. Em seguida, carregue dois mililitros.Adicione qualquer tampão derretido para realizar uma pré-lavagem por filtração. Após a conclusão da lavagem, carregue as células na coluna. Quando a suspensão celular estiver dentro da coluna, adicione um mililitro de tampão derretido e para lavar a coluna; repita esta lavagem mais duas vezes.Não utilize o êmbolo fornecido com a coluna para aumentar a velocidade da filtração. Após a realização de todas as lavagens, centrifugue o filtrado coletado de células não parenquimatosas com esgotamento de CD45 a 200 vezes G durante cinco minutos. Descarte a coluna com as células positivas para CD45 retidas.Em seguida, realiza-se citometria de fluxo para isolar células positivas para CD133, suspendendo as células em tampão Milt, qualquer tampão, 10⁷ células por alíquota de 100 microlitros; distribua 100 microlitros em três tubos. Ao primeiro tubo, adicione dois microlitros de anticorpo conjugado com PE anti-CD133; ao segundo tubo, adicione anticorpo IgG conjugado com PE como controle.O terceiro tubo de células servirá como controle não corado, incubado a quatro graus Celsius por 15 minutos no escuro; após a incubação, ressuspenda em dois mililitros de tampão de marcação, centrifugue a 200 × g por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão Milton e. Em seguida, no citômetro de fluxo, utilize as células não coradas e as células coradas com IGPE para ajustar os parâmetros de ordenação, otimizando o gateamento da população de células positivas para CD133.Nosso FICO ERYN ou RPE pode geralmente ser usado com qualquer citômetro de fluxo que possua um laser que emite 488 nanômetros. Por fim, isole a população de células positivas para CD133 utilizando o gate positivo para CD133 e colete as células em meio para células ovalares estéril e filtrado. As células podem agora ser cultivadas e a isolamento clonal pode ser realizado, seguido por PCR em tempo real para avaliar o status potencial de CD133.Células-tronco hepáticas positivas foram isoladas de camundongos do tipo selvagem e de camundongos com nulificação do gene MAT1A conforme descrito neste vídeo, conforme mostrado aqui. As células positivas para CD133 compõem 0,4% da fração não parenquimatosa altamente enriquecida e empobrecida em CD45, derivada do fígado não lesionado de camundongos do tipo selvagem no modelo genético de nulificação MAT1A −/−, que representa uma lesão hepática crônica. A população positiva para CD133 se expande em dez vezes ou mais na mesma fração altamente enriquecida.Após a triagem, as células foram cultivadas e os clones foram expandidos. Abaixo são mostradas imagens de contraste de fase de quatro colônias derivadas de células individuais positivas para CD133, expandidas em placas de 96 poços revestidas com laminina. Essas células estão sete dias após o isolamento e demonstram colônias pequenas e compactas de células epiteliais no sétimo dia, quando as colônias possuem aproximadamente 25 células.O RNA foi isolado das células e a expressão gênica do marcador de colangiócito CK19 foi analisada, conforme pode ser observado nestes experimentos de RT-PCR. A expressão gênica demonstra a presença do marcador de hepatócito, a albumina, e do marcador de colangiócito CK19, confirmando o potencial das células positivas para CD133 várias semanas após o isolamento inicial de célula única positiva para CD133 e expansão in vitro. Uma vez 10 elevado a seis células do modelo mat1, A--, são injetadas subcutaneamente em camundongos nu desprovidos de sistema imunológico. As setas indicam tumores em crescimento quatro semanas após a injeção das células.Células positivas para CD133 provenientes de lesão hepática crônica induzida por toxinas, como dieta com CCL4 ou 0,1% DDC, não formam tumores. A formação de tumores in vivo é utilizada para identificar o potencial maligno ou o fenótipo de célula-tronco cancerígena dentro da população de células-tronco. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em oito horas, se realizada corretamente.Após seguir este procedimento, a adição de marcadores de fatores adicionais, como EPAM ou outros fatores, pode ser realizada. Técnicas como o flx de população lateral podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como o refinamento dos marcadores de superfície de populações de células progenitoras hepáticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco e progenitoras hepáticas utilizando citometria de fluxo.Não se esqueça de que trabalhar com tecido animal pode ser perigoso, e precauções como o uso de luvas e técnicas laboratoriais adequadas devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

isolation-of-cd133-liver-stem-cells-for-clonal-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.

Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

Este vídeo descreve a técnica de isolamento de células-tronco de melanoma CD133 negativas e positivas de uma linhagem celular primária de melanoma usando classificação de células ativadas por magnetismo. As CSCs de melanoma CD133 positivo são estudadas para entender os mecanismos da tumorigênese do melanoma.

Isolamento de células-tronco de melanoma: um método para obter células de melanoma CD133 positivas e negativas usando classificação de células ativadas por magnetismo

Este vídeo demonstra o isolamento de linfócitos, incluindo células natural killer ou células NK, do tecido hepático humano para expansão seletiva. A digestão enzimática e mecânica, seguida de separação por gradiente de densidade, promove o isolamento de linfócitos, incluindo células NK. Os linfócitos coletados podem ser usados para a expansão seletiva das células NK.

Isolamento de células assassinas naturais do tecido hepático para expansão seletiva

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar camundongos do sistema imunológico humano (HIS). As células-tronco hematopoiéticas CD34+ (HSCs) são isoladas de células do revestimento leucocitário do sangue do cordão umbilical humano usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos. As HSCs CD34+ são expandidas em meio de crescimento enriquecido com citocinas e criopreservadas. Finalmente, os HSCs descongelados são injetados em um filhote de camundongo imunodeficiente para estabelecer o modelo...

Isolando células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical para gerar camundongos do sistema imunológico humano

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como...

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Descrito aqui é um protocolo para isolar e estudar mais detalhadamente os leucócitos infiltrantes da decídua basal e decídua parietalis - a interface materno-fetal humana. Este protocolo mantém a integridade dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, conforme comprovado pela análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Relatamos um método confiável para isolar e cultivar células endoteliais primárias específicas do tumor a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Aprenda a isolar células-tronco hepáticas CD133+ de fígado murino para expansão clonal. Este método utiliza digestão tecidual, separação magnética de CD45 e citometria de fluxo, permitindo análise funcional detalhada.

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Explorar mais vídeos