Liberação de neurotransmissores de imagem usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células

Pegue um camundongo com uma janela craniana contendo uma fina camada de crânio para permitir a visualização do cérebro.

O movimento da cabeça é restrito usando uma barra de cabeça anexada.

O córtex é pré-injetado com repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células, ou CNiFERs, que são células repórteres que permitem a detecção em tempo real da liberação de neurotransmissores.

Os CNiFERs expressam um receptor de neurotransmissor acoplado à proteína G e um detector de cálcio citoplasmático, que consiste em um domínio de ligação ao cálcio fundido a fluoróforos doadores e aceptores.

Usando um microscópio de dois fótons, excite o detector para causar emissão de fluorescência do doador e permita a visualização do CNiFER.

A atividade neuronal que atinge o córtex causa a liberação de neurotransmissores.

Esses neurotransmissores se ligam aos receptores CNiFER e ativam vias de sinalização que induzem a liberação de cálcio do retículo endoplasmático.

O aumento do cálcio citoplasmático se liga ao detector, causando uma mudança conformacional que aproxima os fluoróforos.

O doador transfere energia para o aceptor para estimular a emissão de fluorescência do aceptor, indicando a liberação de neurotransmissores.

Coloque a plataforma de imagem com o mouse com a cabeça presa sob uma objetiva de imersão em água de 10x em um microscópio de imagem de dois fótons. Insira o cubo de filtro para imagens de trastes que tenha um espelho dicróico a 505 nanômetros e filtros passa-banda que abrangem 460 nanômetros a 500 nanômetros para medir ECFP e 520 nanômetros a 560 nanômetros para medir Cidra.

Em seguida, adicione ACSF ao poço, contendo a janela do crânio diluída, e abaixe a objetiva de imersão em água de 10x no ACSF. Use a ocular, em conjunto com a lâmpada de mercúrio e o cubo de filtro GFP para localizar os cNIFERs. Agora, mude para a objetiva de imersão em água 40x.

Em seguida, selecione o caminho de luz apropriado para imagens de dois fótons. Ligue o laser pulsado de femtossegundo infravermelho próximo. Selecione o comprimento de onda de 820 nanômetros e uma configuração de potência de 5 a 15%. Defina a tensão PMT1 e PMT2 para um valor submáximo, normalmente 500 a 1000 volts, dependendo do PMT.

Em seguida, defina o ganho para 1 para cada canal e 0 a posição Z para o objetivo. Abaixe a objetiva aproximadamente 100 a 200 micrômetros da superfície cortical e inicie a varredura x, y. Ajuste o ganho de potência do laser e a tensão PMT para cada canal para otimizar a relação sinal-ruído da fluorescência dos cNIFERs.

Em seguida, use o software para restringir a imagem a uma região que contenha as células cNIFERs, bem como uma região de fundo. Selecione a média da linha de Kalman para dois para obter uma relação sinal-ruído adequada e use uma taxa de varredura de 0,3 a 1 hertz a 4 microssegundos por pixel. Depois disso, desenhe uma ROI ao redor das células cNIFER, cercando cerca de três a quatro células por plano.

Configure a análise em tempo real das intensidades médias do ROI. Em seguida, inicie a aquisição para monitorar a fluorescência do cNIFER ao longo do tempo e inicie a estimulação elétrica ou um experimento comportamental enquanto monitora o traste.