Name: Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a técnica de clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico em ratos conscientes e sem restrição para avaliar a ação da insulina in vivo. Este método minimiza o estresse e melhora a precisão dos dados metabólicos.

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Este trabalho foi financiado pelo Grant 5-U24-DK059637-10 para o Centro de Fenotipagem Vanderbilt rato Metabólica.

<ol><li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+in+vivo+in+four+commonly+used+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains.</a> Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).</li>
<li>Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+glucokinase+gene+copy+number+on+glucose+homeostasis+and+hepatic+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism.</a> J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).</li>
<li>Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+interleukin-6+and+-10+on+skeletal+muscle+and+liver+insulin+action+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo.</a> Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+overexpression+of+lipoprotein+lipase+causes+tissue-specific+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+rosiglitazone+on+skeletal+muscle+and+liver+insulin+resistance+in+A-ZIP%2FF-1+fatless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice.</a> Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-theta+knockout+mice+are+protected+from+fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance.</a> J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+insulin+resistance+in+A-ZIP%2FF-1+fatless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice.</a> J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).</li>
<li>Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+fatty+acid+transport+protein+1+prevents+fat-induced+insulin+resistance+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle.</a> J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-specific+overexpression+of+FOXC2+prevents+diet-induced+increases+in+intramuscular+fatty+acyl+CoA+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance.</a> Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).</li>
<li>Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fat-induced+insulin+resistance+by+salicylate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate.</a> J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).</li>
<li>Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+substrates+to+adipose+tissue+promotes+obesity+in+mice+with+selective+insulin+resistance+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle.</a> J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).</li>
<li>Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+and+the+development+of+diabetes+in+mice+with+muscle-specific+inactivation+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4.</a> J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).</li>
<li>Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+deficiency+does+not+alter+insulin+sensitivity+in+mice+maintained+on+regular+or+high-fat+diet%3A+hyperinsulinemic-euglycemic+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies.</a> Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).</li>
<li>Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+in+the+liver-specific+IGF-1+gene-deleted+mouse+is+abrogated+by+deletion+of+the+acid-labile+subunit+of+the+IGF-binding+protein-3+complex%3A+relative+roles+of+growth+hormone+and+IGF-1+in+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance.</a> Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).</li>
<li>Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+insulin+sensitivity+after+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+agonist+treatment+is+accompanied+by+paradoxical+increase+of+circulating+resistin+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels.</a> Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).</li>
<li>Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+agonist+treatment+in+a+transgenic+model+of+type+2+diabetes+reverses+the+lipotoxic+state+and+improves+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis.</a> Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).</li>
<li>Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epinephrine-induced+insulin+resistance+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epinephrine-induced insulin resistance in man.</a> J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).</li>
<li>Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+mechanisms+for+the+effects+of+epinephrine+on+glucose+production+and+clearance+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man.</a> J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).</li>
<li>Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+in+the+conscious+mouse+is+biphasic+and+pulsatile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).</li>
<li>Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+mice+can+be+distinguished+by+the+period+of+their+islet+calcium+oscillations%3A+is+there+an+intrinsic+islet+period+that+is+imprinted+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo.</a> Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).</li>
<li>Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+function+and+stress+hyperglycemia%3A+plasma+glucose+and+epinephrine+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction.</a> Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterregulatory+deficits+occur+within+24+h+of+a+single+hypoglycemic+episode+in+conscious%2C+unrestrained%2C+chronically+cannulated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-deficient+corticotropin-releasing+hormone+knockout+mice+maintain+glucose+requirements+but+not+autonomic+responses+during+repeated+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucagon-like+peptide-1+receptor+regulates+endogenous+glucose+production+and+muscle+glucose+uptake+independent+of+its+incretin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action.</a> Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).</li>
<li>Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexokinase+II+overexpression+improves+exercise-stimulated+but+not+insulin-stimulated+muscle+glucose+uptake+in+high-fat-fed+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 53, 306-314 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+control+of+glucose+uptake+by+working+muscles+of+conscious+mice%3A+roles+of+transport+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexokinase+II+partial+knockout+impairs+exercise-stimulated+glucose+uptake+in+oxidative+muscles+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).</li>
<li>Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+exercise-stimulated+muscle+glucose+uptake+by+GLUT4+is+dependent+on+glucose+phosphorylation+capacity+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse.</a> J. Biol. Chem. , (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+kinetics+and+exercise+tolerance+in+mice+lacking+the+GLUT4+glucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter.</a> J. Physiol. 582, 801-812 (2007).</li>
<li>Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+fatty+acid+uptake+in+vivo%3A+comparison+of+%5B125I%5D-BMIPP+and+%5B3H%5D-bromopalmitate%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate.</a> Lipids. 43, 703-711 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-, ou clamp de insulina, é amplamente considerado o &quot;padrão ouro&quot; método para avaliar a ação da insulina in vivo. Esta técnica tem sido aplicada para diversas espécies incluindo os humanos, cães, ratos e camundongos. Dado o número crescente de modelos de ratos transgênicos para distúrbios metabólicos, a miniaturização da técnica para uso no mouse tem proporcionado avanços significativos para a investigação metabólica. Enquanto os conceitos por trás do grampo de insulina são simples, na prática existem diferentes abordagens para a realização de experimentos clamp de insulina. Este não é um ponto trivial, uma vez que a maneira pela qual a experiência é realizada afeta os resultados obtidos 1. Aqui nós apresentamos o protocolo usado pelo MMPC Vanderbilt. A distinção fundamental entre o nosso protocolo e que dos outros é que usamos um cateter arterial para a obtenção de amostras de sangue. Isto está em contraste com a abordagem mais amplamente utilizado de obtaining amostras de sangue, cortando a ponta da cauda 4, 7, 11, 12, 14-17. A vantagem da amostragem de um cateter arterial é que o experimento é conduzido em um rato consciente e irrestrita. Amostragem da cauda muitas vezes exige contenção e aumenta os índices de stress quando grandes amostras de sangue são adquiridas 1. Hormônios do estresse estimular a produção endógena de glicose e prejudicar a disponibilidade de glicose 18, 19, potencialmente dando a aparência de um fenótipo de resistência à insulina. Amostragem da cauda cortada pode exigir Animal Care especiais Institucional e aprovação do Comitê Use devido à sua natureza estressante. O procedimento de cateterismo arterial foi desenvolvido para evitar o estresse para o mouse de cortar a cauda. Um aspecto fundamental da realização de grampos de insulina é a capacidade de manter euglicemia. Não há algoritmos que podem prever corretamente como o GIR deve ser ajustada com base em leituras de glicose no sangue. Como a cirurgia,pessoal conduzindo experimentos clamp de insulina vai se tornar proficientes em manter euglicemia razoável apenas através da experiência. É importante notar que devido à sua maior taxa metabólica dos dados obtidos a partir de estudos do mouse será inerentemente barulhentas. Isso faz com que a apresentação completa dos dados, incluindo os períodos de glicose e GIR e valores absolutos de insulina plasmática, Endora, Rd e Rg crucial para a capacidade de qualquer leitor a interpretar os resultados. As taxas de glicose de alto fluxo no mouse (aproximadamente 5 vezes superior à taxa em humanos) garante uma alta freqüência de amostragem de glicose. Enquanto o volume de sangue do mouse é limitado, uma frequência de amostragem mínima de uma vez a cada 10 minutos é necessário ter certeza de que uma pinça adequada foi alcançada. Conforme mostrado na Figura 4, os níveis de insulina grampo pode ser diferente entre os grupos. Fatores como dieta intervenções, manipulações transgênicos ou diferenças em cepas de fundo pode afetar fasos níveis de insulina ting, que podem posteriormente afetar os níveis de insulina grampo. Interpretação dos resultados quando os níveis de insulina pinça são diferentes pode ser problemático. Isto pode ser experimentalmente solucionado através de experiências-piloto para selecionar taxas de perfusão de insulina que atingir níveis de fixação equivalente à insulina entre os grupos. Alternativamente, a somatostatina pode ser usado para inibir a secreção do hormônio pancreático e insulina e glucagon pode ser substituído a taxas controladas experimentalmente. Esta última abordagem é mais comumente feito em grampos de insulina em ratos do que os ratos. Se essas abordagens experimentais não forem tomadas, o GIR steady-state pode ser normalizada para o nível de insulina grampo, ou um índice de sensibilidade à insulina (S I) pode ser derivada a partir de dados como braçadeira S I = GIR / (G • ΔI), onde G é a concentração de glicose no steady-state e ΔI é a diferença entre jejum e concentrações de insulina grampo. Uma hipótese com qualquer abordagem é que o nível de insulina clamp alcançado édentro da faixa em que a sensibilidade à insulina é linearmente relacionada com o nível de insulina de acordo com o grupo estudado. Esta última hipótese pode não se aplicar ao comparar resistentes à insulina e grupos sensíveis à insulina. Idealmente, uma curva dose-resposta de insulina devem ser gerados para selecionar a infusão de insulina adequada. No entanto, devido a exigência de experimentos adicionais, isso raramente é feito. A versatilidade fornecida pelo cateterismo arterial estende-se a abordagens experimentais para além grampos euglicêmico. Por exemplo, grampos hiperglicêmico, no qual a glicose é infundida a uma taxa variável para manter a hiperglicemia em relação à glicemia de jejum, pode ser usado para avaliar a função pancreática endógena in vivo 2, 20, 21. A medição da secreção de insulina durante a primeira fase deste teste requer a aquisição freqüente de amostras de sangue (ou seja, a cada min 2-5), o que não é viável quando a obtenção de amostras da ponta da cauda. Além disso,catecolaminas elevadas decorrentes da amostragem cauda pode prejudicar a secreção de insulina e glucagon aumentar a secreção 22. O protocolo de clamp de insulina também pode ser modificada para permitir a queda da glicemia para hipoglicemia relativa para avaliar contra-reguladores de resposta de 2, 23, 24. Cateterismo arterial também pode ser usado para avaliar a dinâmica do metabolismo da glicose durante o exercício 25-30. Isso é significativamente vantajosos em relação as abordagens convencionais realizados em momentos único pré e pós-exercício ou in vivo isolado músculos ex. As técnicas apresentadas aqui podem também ser usados ​​para avaliar não apenas a glicose, mas também o metabolismo de ácidos graxos 31.

hiperinsulinêmico euglicêmico-clamps em consciente, ratos unrestrained

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Diabetes tipo 2 é caracterizada por um defeito na ação da insulina. O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-, ou clamp de insulina, é amplamente considerado o &quot;padrão ouro&quot; método para avaliar a ação da insulina in vivo. Durante uma pinça de insulina, hiperinsulinemia é alcançado por uma infusão de insulina constante. Euglicemia é mantida através de uma infusão de glicose concomitante a uma taxa variável. Esta taxa de infusão variável de glicose (GIR) é determinada pela medição de glicose no sangue em breves intervalos durante todo o experimento e ajustar o GIR em conformidade. O GIR é indicativo de corpo inteiro ação da insulina, como os ratos com a ação da insulina maior exigem uma maior GIR. O grampo de insulina pode incorporar a administração de dois isótopos [14 C] deoxiglicose para avaliar tecido-específicos a absorção de glicose e [3-3 H] glicose para avaliar a capacidade da insulina de suprimir a taxa de aparecimento de glicose endógena (Endora), um marcador de produção hepática de glicose, e estimular ataxa de desaparecimento de corpo inteiro de glicose (Rd). A miniaturização do clamp de insulina para uso em modelos de ratos genética da doença metabólica tem levado a avanços significativos na pesquisa do diabetes. Métodos para a realização de grampos de insulina variam entre os laboratórios. É importante notar que a maneira pela qual um grampo de insulina é realizada pode afetar significativamente os resultados obtidos. Nós publicamos uma avaliação exaustiva das diferentes abordagens para a realização de grampos de insulina em ratos conscientes 1, bem como uma avaliação da resposta metabólica de quatro comumente usado puras linhagens de camundongos através de técnicas de fixação diversos 2. Aqui apresentamos um protocolo para a realização de grampos de insulina sobre consciente, ratos desenfreada desenvolvido pelo rato Vanderbilt Metabólica Fenotipagem Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / MMPC). Isso inclui uma descrição do método para a implantação de cateteres utilizados durante o clamp de insulina. O protocolo empregado peloVanderbilt MMPC utiliza um sistema de 3 únicos dois cateteres. Um cateter é inserido na veia jugular para infusões. Um segundo cateter é inserido na artéria carótida, que permite a coleta de sangue sem a necessidade de conter ou lidar com o mouse. Esta técnica oferece uma vantagem significativa para o método mais comum de obtenção de amostras de sangue durante grampos insulina, que é a amostra da ponta da cauda decepada. Ao contrário deste último método, a amostragem de um cateter arterial não é estressante para o mouse 1. Descrevemos também métodos para usar infusões traçador isotópico para avaliar tecido-específicos a ação da insulina. Nós também fornecemos orientações para a apresentação adequada dos resultados obtidos a partir de grampos de insulina.

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-, ou clamp de insulina, é o padrão ouro para avaliar a ação da insulina<em&gt; In vivo</em&gt;. Um método para a realização de grampos de insulina em ratos é descrito. Isto inclui um método para cateterização arterial que permite experimentos a serem realizados no consciente, camundongos sem impedimentos, com o mínimo de stress.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

O diabetes tipo 2 é caracterizado por um defeito na ação da insulina. O clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico, ou clamp de insulina, é amplamente considerado o "padrão...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a ação da insulina em todo o organismo e em tecidos específicos em camundongos conscientes e não estressados, sem manipulá-los. Isso é conseguido mediante a implantação cirúrgica de um cateter na veia jugular para infusões e outro na artéria carótida para coleta de amostras sanguíneas. Após um período de recuperação de cinco a sete dias, camundongos que foram submetidos a jejum por cinco horas recebem infusão de insulina para atingir hiperinsulinemia fisiológica.Os níveis de glicose são então medidos a partir do cateter arterial, e a glicemia basal é mantida ajustando a taxa de infusão de glicose. Este experimento permite a medição de diferenças na sensibilidade à insulina em todo o organismo com base na relação direta entre a taxa de infusão de glicose necessária para manter a glicemia basal e a ação da insulina. A principal vantagem desta técnica em comparação com os métodos existentes para coleta de sangue, como o corte da cauda, é que o cateter arterial implantado cirurgicamente nos fornece acesso vascular ao camundongo, permitindo a obtenção de amostras de sangue sem a necessidade de manipular o animal.Isso nos permite realizar esses experimentos com camundongos não estressados e sem restrições. O cateter arterial é feito inserindo-se um pedaço biselado de tubo PE 10 em um pedaço de tubo astic de seis centímetros, de modo que o PE 10 se estenda 0,9 centímetros a partir do sel. O cateter venoso é um pedaço de tubo SEL de seis centímetros com colarinho.A massa é construída inserindo-se pedaços de três centímetros de PE 20 em cada um dos dois conectores de aço inoxidável 25 gauge de 1,3 centímetro, Ben, formando um ângulo aproximado de 120 graus. Estes são inseridos em uma gota de adesivo de silicone médico conforme mostrado aqui. Para iniciar a implantação do cateter, coloque um camundongo anestesiado sobre uma superfície de trabalho limpa utilizando técnica estéril. Faça uma incisão de cinco milímetros à direita da linha média.Isolar a veia jugular direita. Ligar cuidadosamente a cefálica, finalizando com sutura de seda, e amarrar frouxamente outra parte da sutura na extremidade caudal. Em seguida, cortar logo abaixo da ligadura cefálica com tesoura de mola e inserir o cateter até o ponto de contenção.Amarrar uma sutura atrás da conta e confirmar que o cateter coleta amostras conectando a extremidade livre do cateter a uma seringa de coleta. Para posicionar o cateter arterial, fazer uma pequena incisão, cinco milímetros à esquerda do esterno e cefálica à primeira incisão. Isolar a artéria carótida esquerda, em seguida ligar a porção cefálica.Finalize com sutura de seda e dê um nó solto. Coloque outro pedaço de sutura na extremidade causal do vaso exposto. Em seguida, prenda a extremidade caudal do vaso com uma pinça.E corte logo abaixo da extremidade ligada com tesoura de mola. Insira cuidadosamente o cateter até o grampo. Libere cuidadosamente o grampo e avance o cateter até a junção P de Astic.Fixe as ligaduras firmemente ao cateter e confirme a coleta pelo cateter conectando a extremidade livre do cateter a uma seringa de coleta. Em seguida, vire o animal e faça uma pequena incisão entre as escápulas para criar um túnel, usando uma agulha de calibre 14 sob a pele, desde as incisões na parte frontal até essa incisão na região dorsal. Passe os cateteres através da agulha para exteriorizá-los na parte traseira do camundongo.Conecte os cateteres arterial e venoso aos conectores apropriados na antena do camundongo para acesso à amostragem ou ao masa. Em seguida, insira o masa na incisão entre as escápulas. Feche ambas as incisões com sutura de náilon.Confirme a patência de ambos os cateteres. Coloque o camundongo em uma gaiola limpa e aquecida para recuperação e permita que ele se recupere por pelo menos cinco dias antes do clamp de insulina. O passo mais difícil ao realizar um clamp hiperglicêmico hiperglicêmico em camundongos é tentar manter a glicemia constante.Os camundongos possuem um metabolismo muito rápido e seus níveis de glicose podem mudar significativamente durante a duração do experimento. Isso exige alguma prática para desenvolver uma percepção de como os níveis de glicose de um camundongo irão variar ao longo de um experimento e, em seguida, como ajustar a taxa de infusão de glicose para manter a glicemia constante. A montagem para um clamp padrão é mostrada aqui.Três infusões de oito, glicose, insulina e eritrócitos lavados são conectadas a um conector de quatro vias ligado a um rotatório e suspenso acima do camundongo. A porta de infusão do rotatório é conectada ao cateter venoso. Antes de conectar o camundongo, preencha todas as linhas de infusão de oito com soro fisiológico.Em seguida, encha a linha de amostragem com solução salina heparinizada. Deixe uma seringa com solução salina heparinizada conectada à extremidade superior do conector giratório da seringa de limpeza. Inicie o jejum dos camundongos cinco a seis horas antes do início do clamp.Três horas após o início do jejum, pese o camundongo e conecte os cateteres venoso e arterial às linhas de infusão e coleta, respectivamente. Quinze minutos antes do início do clamp, insira uma gota de glicose em branco em um glicosímetro portátil. Em seguida, aspire aproximadamente 50 microlitros de sangue na seringa de limpeza para remover qualquer solução salina da linha e desconecte a seringa de limpeza.Meça o nível de glicose no sangue tocando a tira de glicose na gota de sangue que se forma na extremidade do tubo. Em seguida, insira uma seringa com agulha romba na linha de amostragem e aspire 50 microlitros de sangue. Transfira o sangue para um tubo revestido com EDTA e centrifugue o tubo para coletar o plasma para as medições de hormônios e metabólitos basais.Neste momento, reinsira a seringa de limpeza e puxe o êmbolo. Para remover bolhas de ar, reinfunda os 50 microlitros de sangue que foram originalmente coletados. Anote o valor da glicemia obtido no glicosímetro.Dez minutos depois, use o glicosímetro e a seringa de limpeza para repetir a medição da glicose sanguínea e, em seguida, colete outros 50 microlitros de sangue para obter outra amostra de plasma. Após as segundas medições basais serem realizadas, encha as linhas de infusão de glicose, insulina e eritrócitos lavados com soro fisiológico até o conector de quatro vias. Conecte o conector de quatro vias ao tubo ligado ao porto de infusão com coletor rotativo.Inicie infundindo os eritrócitos lavados com soro fisiológico. Ajuste a taxa de infusão para substituir o volume total de sangue coletado durante o período do estudo. Assim que a infusão de eritrócitos atingir o camundongo, inicie as infusões de insulina e glicose.Este é o tempo igual a zero minutos. A insulina é infundida a uma taxa constante predeterminada. A taxa inicial de infusão de glicose é estimada com base nos níveis basais de glicose no sangue e na experiência prévia.Nas próximas duas horas, realize leituras da glicemia com o glicosímetro e ajuste a taxa de infusão de glicose para manter a glicemia-alvo. Em intervalos de 10 minutos, registre as novas leituras de glicose e as taxas de infusão de glicose aos 100 e 120 minutos, coletando sangue adicional para a medição da insulina plasmática e de quaisquer outros hormônios ou metabólitos. É apresentado aqui o curso temporal dos níveis de glicose durante todo o procedimento do clamp, demonstrando quão bem a glicemia foi mantida tanto em camundongos alimentados com ração padrão quanto naqueles alimentados com dieta rica em gordura. O curso temporal da taxa de infusão de glicose mostra que a taxa necessária para manter a glicemia é significativamente menor no grupo alimentado com dieta rica em gordura, indicando um comprometimento da ação insulínica em todo o organismo.Os níveis de insulina em jejum e durante o clamp também são mais elevados no grupo alimentado com dieta rica em gordura, reforçando ainda mais a presença de um fenótipo resistente à insulina. Nestes camundongos, a glicose tritiada é utilizada para estimar a taxa de aparecimento endógeno de glicose. Endo a é um índice da produção hepática de glicose, enquanto a insulina suprime completamente o endo A em camundongos controle.A supressão é prejudicada em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura. De forma semelhante, a glicose TRID é utilizada para estimar a taxa de desaparecimento da glicose no organismo inteiro. Rd, a capacidade da insulina de estimular RD está comprometida em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura.A glicose desoxi contendo carbono 14 é utilizada para avaliar o índice metabólico de glicose RG, uma medida da captação de glicose específica do tecido. Como observado neste exemplo, a captação de glicose estimulada por insulina no músculo esquelético é prejudicada em camundongos alimentados com dieta rica em gordura. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a microcirurgia necessária para implantar os cateteres arteriais e venosos.A cirurgia exige habilidades muito especializadas e requer prática constante durante vários meses para tornar-se altamente competente na realização da cirurgia para o clamp hiperglicêmico hiperglicêmico, sendo a dificuldade novamente a de tentar manter a glicemia U em um modelo animal com um metabolismo muito elevado.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-é o "padrão ouro" para a avaliação da ação da insulina. A insulina é infundida a uma taxa constante estimulando a captação de glicose. A quantidade de glicose exógena infundido para combater essa queda é um indicativo de sensibilidade à insulina. Aqui, o procedimento é realizado em um rato, consciente desenfreada.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamp in the Rat Consciente

Este protocolo estuda o papel do ligante de chemokine (C-C motif) 5 (CCL5) no hipotálamo, entregando um antagonista, MetCCL5, dentro do cérebro de rato usando um sistema de infusão de cérebro de bomba micro-osmótica. Esta inibição transitória de CCL5 atividade interrompida hipotalâmica insulina sinalização, levando à intolerância à glicose e a sensibilidade periférica à insulina sistêmica.

Estudando o sinal de insulina hipotalâmico a intolerância de glicose periférica com um sistema de infusão contínua de drogas dentro do cérebro de rato

Um clamp hiperglicêmico é usado para medir a liberação de insulina com uma concentração de glicose no sangue mais alta mantida. Uma pinça hipoglicemiante serve para medir a produção de glicose induzida por respostas contra-regulatórias. Ambos os métodos utilizam o mesmo procedimento cirúrgico. Apresentamos aqui uma técnica de clamp para avaliar o metabolismo sistêmico da glicose.

Clamp hiperglicêmico e grampo hipoglicêmico em camundongos conscientes

Aqui, fornecemos detalhes sobre a realização da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) via perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto como uma técnica adicional para avaliar a função pancreática endócrina com redução de possíveis fatores de confusão.

Secreção de insulina estimulada por glicose via perfusão através da vasculatura de camundongos com pâncreas intacto

Estimulação elétrica programada fornece a capacidade para determinar as propriedades de condução do coração, ea possibilidade de induzir e terminar arritmias cardíacas usando protocolos de estimulação diferentes. Usando um cateter transvenoso, gravações de eletrograma intracardíaco pode ser obtido em camundongos após programado protocolos de estimulação elétrica para identificar substratos arritmogênicos.

Estimulação elétrica programada em Ratos

O ecocardiograma transtorácico oferece um método não invasivo para a avaliação da função cardíaca em camundongos. A combinação de ultra-som Doppler e modalidades podem ser usadas para obter medições dimensionais do coração eo fluxo sangüíneo intracardíaco, que juntos fornecem uma avaliação da pressão arterial sistólica cardíaca diastólica e desempenho.

Ecocardiografia transtorácica em Ratos

Acessos vasculares para medir a hemodinâmica, fornecer fluidos e realizar amostras de sangue são importantes para qualquer estudo de modelo de pequenos animais. Apresentamos uma técnica de implante de cateteres na artéria carótida e na veia jugular comum em um rato anestesiado para conexão a um sistema para realização de monitoramento, infusões e amostragem.

Cateterismo da artéria carótida e jugular para executar as medidas hemodinâmicas, infusões e Sangue de amostragem em um Rat Consciente Modelo

Este método foi desenvolvido com o objectivo de proporcionar uma solução de fármaco estável através da artéria carótida, para avaliar a farmacocinética de drogas novas em modelos de rato.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

A determinação da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão-ouro para avaliar a função renal geral. No entanto, os procedimentos tradicionais para medir esse parâmetro são complicados e exigem um grande investimento de tempo. Aqui descrevemos um método mais rápido e minimamente invasivo para determinar a TFG por via transcutânea.

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Ratos anestesiados exibem não-fisiológicos pressão arterial sistêmica, que impede a avaliação significativa do tônus autonômico, dada a íntima relação entre a pressão arterial e o sistema nervoso autônomo. Assim, um método novo para a atividade do nervo simpático renal simultaneamente recorde e a pressão arterial com infusão intravenosa em ratos conscientes é descrito.

Nova abordagem para gravação simultânea da atividade do nervo simpático Renal e pressão arterial com infusão intravenosa em consciente, ratos desenfreados.

Aprenda a técnica de clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico em ratos conscientes e sem restrição para avaliar a ação da insulina in vivo. Este método minimiza o estresse e melhora a precisão dos dados metabólicos.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

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