Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a ação da insulina em todo o organismo e em tecidos específicos em camundongos conscientes e não estressados, sem manipulá-los. Isso é conseguido mediante a implantação cirúrgica de um cateter na veia jugular para infusões e outro na artéria carótida para coleta de amostras sanguíneas. Após um período de recuperação de cinco a sete dias, camundongos que foram submetidos a jejum por cinco horas recebem infusão de insulina para atingir hiperinsulinemia fisiológica.

Os níveis de glicose são então medidos a partir do cateter arterial, e a glicemia basal é mantida ajustando a taxa de infusão de glicose. Este experimento permite a medição de diferenças na sensibilidade à insulina em todo o organismo com base na relação direta entre a taxa de infusão de glicose necessária para manter a glicemia basal e a ação da insulina. A principal vantagem desta técnica em comparação com os métodos existentes para coleta de sangue, como o corte da cauda, é que o cateter arterial implantado cirurgicamente nos fornece acesso vascular ao camundongo, permitindo a obtenção de amostras de sangue sem a necessidade de manipular o animal.

Isso nos permite realizar esses experimentos com camundongos não estressados e sem restrições. O cateter arterial é feito inserindo-se um pedaço biselado de tubo PE 10 em um pedaço de tubo astic de seis centímetros, de modo que o PE 10 se estenda 0,9 centímetros a partir do sel. O cateter venoso é um pedaço de tubo SEL de seis centímetros com colarinho.

A massa é construída inserindo-se pedaços de três centímetros de PE 20 em cada um dos dois conectores de aço inoxidável 25 gauge de 1,3 centímetro, Ben, formando um ângulo aproximado de 120 graus. Estes são inseridos em uma gota de adesivo de silicone médico conforme mostrado aqui. Para iniciar a implantação do cateter, coloque um camundongo anestesiado sobre uma superfície de trabalho limpa utilizando técnica estéril. Faça uma incisão de cinco milímetros à direita da linha média.

Isolar a veia jugular direita. Ligar cuidadosamente a cefálica, finalizando com sutura de seda, e amarrar frouxamente outra parte da sutura na extremidade caudal. Em seguida, cortar logo abaixo da ligadura cefálica com tesoura de mola e inserir o cateter até o ponto de contenção.

Amarrar uma sutura atrás da conta e confirmar que o cateter coleta amostras conectando a extremidade livre do cateter a uma seringa de coleta. Para posicionar o cateter arterial, fazer uma pequena incisão, cinco milímetros à esquerda do esterno e cefálica à primeira incisão. Isolar a artéria carótida esquerda, em seguida ligar a porção cefálica.

Finalize com sutura de seda e dê um nó solto. Coloque outro pedaço de sutura na extremidade causal do vaso exposto. Em seguida, prenda a extremidade caudal do vaso com uma pinça.

E corte logo abaixo da extremidade ligada com tesoura de mola. Insira cuidadosamente o cateter até o grampo. Libere cuidadosamente o grampo e avance o cateter até a junção P de Astic.

Fixe as ligaduras firmemente ao cateter e confirme a coleta pelo cateter conectando a extremidade livre do cateter a uma seringa de coleta. Em seguida, vire o animal e faça uma pequena incisão entre as escápulas para criar um túnel, usando uma agulha de calibre 14 sob a pele, desde as incisões na parte frontal até essa incisão na região dorsal. Passe os cateteres através da agulha para exteriorizá-los na parte traseira do camundongo.

Conecte os cateteres arterial e venoso aos conectores apropriados na antena do camundongo para acesso à amostragem ou ao masa. Em seguida, insira o masa na incisão entre as escápulas. Feche ambas as incisões com sutura de náilon.

Confirme a patência de ambos os cateteres. Coloque o camundongo em uma gaiola limpa e aquecida para recuperação e permita que ele se recupere por pelo menos cinco dias antes do clamp de insulina. O passo mais difícil ao realizar um clamp hiperglicêmico hiperglicêmico em camundongos é tentar manter a glicemia constante.

Os camundongos possuem um metabolismo muito rápido e seus níveis de glicose podem mudar significativamente durante a duração do experimento. Isso exige alguma prática para desenvolver uma percepção de como os níveis de glicose de um camundongo irão variar ao longo de um experimento e, em seguida, como ajustar a taxa de infusão de glicose para manter a glicemia constante. A montagem para um clamp padrão é mostrada aqui.

Três infusões de oito, glicose, insulina e eritrócitos lavados são conectadas a um conector de quatro vias ligado a um rotatório e suspenso acima do camundongo. A porta de infusão do rotatório é conectada ao cateter venoso. Antes de conectar o camundongo, preencha todas as linhas de infusão de oito com soro fisiológico.

Em seguida, encha a linha de amostragem com solução salina heparinizada. Deixe uma seringa com solução salina heparinizada conectada à extremidade superior do conector giratório da seringa de limpeza. Inicie o jejum dos camundongos cinco a seis horas antes do início do clamp.

Três horas após o início do jejum, pese o camundongo e conecte os cateteres venoso e arterial às linhas de infusão e coleta, respectivamente. Quinze minutos antes do início do clamp, insira uma gota de glicose em branco em um glicosímetro portátil. Em seguida, aspire aproximadamente 50 microlitros de sangue na seringa de limpeza para remover qualquer solução salina da linha e desconecte a seringa de limpeza.

Meça o nível de glicose no sangue tocando a tira de glicose na gota de sangue que se forma na extremidade do tubo. Em seguida, insira uma seringa com agulha romba na linha de amostragem e aspire 50 microlitros de sangue. Transfira o sangue para um tubo revestido com EDTA e centrifugue o tubo para coletar o plasma para as medições de hormônios e metabólitos basais.

Neste momento, reinsira a seringa de limpeza e puxe o êmbolo. Para remover bolhas de ar, reinfunda os 50 microlitros de sangue que foram originalmente coletados. Anote o valor da glicemia obtido no glicosímetro.

Dez minutos depois, use o glicosímetro e a seringa de limpeza para repetir a medição da glicose sanguínea e, em seguida, colete outros 50 microlitros de sangue para obter outra amostra de plasma. Após as segundas medições basais serem realizadas, encha as linhas de infusão de glicose, insulina e eritrócitos lavados com soro fisiológico até o conector de quatro vias. Conecte o conector de quatro vias ao tubo ligado ao porto de infusão com coletor rotativo.

Inicie infundindo os eritrócitos lavados com soro fisiológico. Ajuste a taxa de infusão para substituir o volume total de sangue coletado durante o período do estudo. Assim que a infusão de eritrócitos atingir o camundongo, inicie as infusões de insulina e glicose.

Este é o tempo igual a zero minutos. A insulina é infundida a uma taxa constante predeterminada. A taxa inicial de infusão de glicose é estimada com base nos níveis basais de glicose no sangue e na experiência prévia.

Nas próximas duas horas, realize leituras da glicemia com o glicosímetro e ajuste a taxa de infusão de glicose para manter a glicemia-alvo. Em intervalos de 10 minutos, registre as novas leituras de glicose e as taxas de infusão de glicose aos 100 e 120 minutos, coletando sangue adicional para a medição da insulina plasmática e de quaisquer outros hormônios ou metabólitos. É apresentado aqui o curso temporal dos níveis de glicose durante todo o procedimento do clamp, demonstrando quão bem a glicemia foi mantida tanto em camundongos alimentados com ração padrão quanto naqueles alimentados com dieta rica em gordura. O curso temporal da taxa de infusão de glicose mostra que a taxa necessária para manter a glicemia é significativamente menor no grupo alimentado com dieta rica em gordura, indicando um comprometimento da ação insulínica em todo o organismo.

Os níveis de insulina em jejum e durante o clamp também são mais elevados no grupo alimentado com dieta rica em gordura, reforçando ainda mais a presença de um fenótipo resistente à insulina. Nestes camundongos, a glicose tritiada é utilizada para estimar a taxa de aparecimento endógeno de glicose. Endo a é um índice da produção hepática de glicose, enquanto a insulina suprime completamente o endo A em camundongos controle.

A supressão é prejudicada em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura. De forma semelhante, a glicose TRID é utilizada para estimar a taxa de desaparecimento da glicose no organismo inteiro. Rd, a capacidade da insulina de estimular RD está comprometida em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura.

A glicose desoxi contendo carbono 14 é utilizada para avaliar o índice metabólico de glicose RG, uma medida da captação de glicose específica do tecido. Como observado neste exemplo, a captação de glicose estimulada por insulina no músculo esquelético é prejudicada em camundongos alimentados com dieta rica em gordura. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a microcirurgia necessária para implantar os cateteres arteriais e venosos.

A cirurgia exige habilidades muito especializadas e requer prática constante durante vários meses para tornar-se altamente competente na realização da cirurgia para o clamp hiperglicêmico hiperglicêmico, sendo a dificuldade novamente a de tentar manter a glicemia U em um modelo animal com um metabolismo muito elevado.