Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

Pegue duas cepas transgênicas separadas de Caenorhabditis elegans em lâminas com almofadas de ágar. As almofadas contêm uma solução de rolamento com um agente paralisante que minimiza o movimento.

O cordão nervoso ventral dos vermes, ou VNC, contém interneurônios excitatórios que expressam indicadores de cálcio citoplasmático em uma cepa e indicadores de cálcio mitocondrial na outra.

Coloque uma lamínula para rolar os vermes, orientando o VNC para visualização, e posicione-os sob um microscópio de fluorescência.

Use a luz visível para localizar os vermes e, em seguida, mude para o modo de fluorescência.

Nos neurônios em repouso, o baixo cálcio intracelular mantém os indicadores desligados, resultando em fluorescência fraca.

A atividade neuronal espontânea abre canais de cálcio dependentes de voltagem, permitindo o influxo de cálcio.

Na cepa com indicadores citoplasmáticos, o cálcio se liga aos indicadores, aumentando a fluorescência citoplasmática.

O excesso de cálcio citoplasmático entra nas mitocôndrias através dos canais. Na cepa com indicadores mitocondriais, a ligação ao cálcio aumenta a fluorescência mitocondrial.

Visualize os neurônios em ambas as cepas para monitorar a dinâmica do cálcio subcelular.

Em um tubo de cultura de vidro de 13 por 100 milímetros, prepare 3 mililitros de ágar 10% dissolvendo o ágar de grau molecular em M9 e leve ao microondas por vários segundos. Para fazer as almofadas de ágar, primeiro prepare duas lâminas adicionando duas camadas de fita adesiva de laboratório. Em seguida, coloque uma lâmina de microscópio entre as duas lâminas. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar no centro da lamínula.

Achate o ágar-ágar pressionando outra lâmina para baixo em cima do ágar. Após o resfriamento, corte o ágar-ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de 10 mililitros e, em seguida, remova o ágar ao redor. Em seguida, prepare a solução de rolamento de minhoca dissolvendo o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 milimolares. Dilua o estoque na proporção de um para um com contas de poliestireno para fazer a solução de laminação.

Para posicionar o verme para a imagem, coloque primeiro 1,6 microlitros da solução de rolamento no centro da almofada de ágar. Em seguida, usando um picareta de minhoca preferido, transfira um verme da idade desejada para a solução de rolamento na almofada de ágar. Aguarde cerca de cinco minutos para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma lamínula de 22 por 22 milímetros em cima da almofada de ágar.

Para neuritos de imagem no cordão nervoso ventral, role o verme deslizando levemente a lamínula. Para montar o verme no microscópio, coloque uma gota de óleo de imersão na lamínula. Encontre o verme usando uma objetiva de baixa ampliação em campo claro. Em seguida, mude para a objetiva de 100X e localize o neurite AVA usando a iluminação do GCaMP ou mito-GCaMP com o laser de imagem de 488 nanômetros.