Por que o teste de hipótese nula é importante para a imagem de cálcio em neurônios de C. elegans?

O teste de hipótese nula garante que as alterações observadas na fluorescência reflitam dinâmicas reais de cálcio, e não variações aleatórias, apoiando uma validação robusta de alvos em estudos de sinalização neuronal.

Como o isolamento da variável independente se encaixa no fluxo de trabalho de imagem de cálcio subcelular?

O isolamento de variáveis, como o tipo de indicador ou o estado de atividade neuronal, permite que as equipes atribuam alterações na fluorescência especificamente ao fluxo de cálcio citoplasmático ou mitocondrial, esclarecendo as vias mecanicistas.

O que permitem as medições quantitativas de fluorescência de cálcio no desenvolvimento de ensaios?

As saídas quantitativas de fluorescência fornecem métricas padronizadas e reprodutíveis para comparar respostas neuronais, permitindo o desenvolvimento confiável de ensaios e triagem de compostos direcionados à dinâmica do cálcio.

Por que os requisitos de replicação são críticos para estudos de imagem de cálcio multifuncionais?

A replicação garante que as medidas de fluxo de cálcio sejam consistentes entre experimentos e equipes, apoiando a colaboração multifuncional e a confiança em decisões baseadas em dados.

Quais capacidades de análise estatística são necessárias antes de implementar as saídas de imagem de cálcio?

É necessária uma análise estatística robusta para interpretar as alterações na intensidade da fluorescência, distinguir sinal de ruído e validar os resultados para aplicações downstream em P&D.

Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurociência

0 vistas • 3:17 min • June 17th, 2025

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Pegue duas cepas transgênicas separadas de Caenorhabditis elegans em lâminas com almofadas de ágar. As almofadas contêm uma solução de rolamento com um agente paralisante que minimiza o movimento.

O cordão nervoso ventral dos vermes, ou VNC, contém interneurônios excitatórios que expressam indicadores de cálcio citoplasmático em uma cepa e indicadores de cálcio mitocondrial na outra.

Coloque uma lamínula para rolar os vermes, orientando o VNC para visualização, e posicione-os sob um microscópio de fluorescência.

Use a luz visível para localizar os vermes e, em seguida, mude para o modo de fluorescência.

Nos neurônios em repouso, o baixo cálcio intracelular mantém os indicadores desligados, resultando em fluorescência fraca.

A atividade neuronal espontânea abre canais de cálcio dependentes de voltagem, permitindo o influxo de cálcio.

Na cepa com indicadores citoplasmáticos, o cálcio se liga aos indicadores, aumentando a fluorescência citoplasmática.

O excesso de cálcio citoplasmático entra nas mitocôndrias através dos canais. Na cepa com indicadores mitocondriais, a ligação ao cálcio aumenta a fluorescência mitocondrial.

Visualize os neurônios em ambas as cepas para monitorar a dinâmica do cálcio subcelular.

Em um tubo de cultura de vidro de 13 por 100 milímetros, prepare 3 mililitros de ágar 10% dissolvendo o ágar de grau molecular em M9 e leve ao microondas por vários segundos. Para fazer as almofadas de ágar, primeiro prepare duas lâminas adicionando duas camadas de fita adesiva de laboratório. Em seguida, coloque uma lâmina de microscópio entre as duas lâminas. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar no centro da lamínula.

Achate o ágar-ágar pressionando outra lâmina para baixo em cima do ágar. Após o resfriamento, corte o ágar-ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de 10 mililitros e, em seguida, remova o ágar ao redor. Em seguida, prepare a solução de rolamento de minhoca dissolvendo o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 milimolares. Dilua o estoque na proporção de um para um com contas de poliestireno para fazer a solução de laminação.

Para posicionar o verme para a imagem, coloque primeiro 1,6 microlitros da solução de rolamento no centro da almofada de ágar. Em seguida, usando um picareta de minhoca preferido, transfira um verme da idade desejada para a solução de rolamento na almofada de ágar. Aguarde cerca de cinco minutos para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma lamínula de 22 por 22 milímetros em cima da almofada de ágar.

Para neuritos de imagem no cordão nervoso ventral, role o verme deslizando levemente a lamínula. Para montar o verme no microscópio, coloque uma gota de óleo de imersão na lamínula. Encontre o verme usando uma objetiva de baixa ampliação em campo claro. Em seguida, mude para a objetiva de 100X e localize o neurite AVA usando a iluminação do GCaMP ou mito-GCaMP com o laser de imagem de 488 nanômetros.