Name: Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a purificar a Hsp104, uma disaggregase proteica AAA+ hexamérica de levedura, usando cromatografia de afinidade, troca iônica e exclusão molecular. Este método produz proteína altamente ativa para estudos estruturais e funcionais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por uma concessão do NIH (5T32GM008275-22) e um American Heart Association predoctoral comunhão (para EAS); uma bolsa de interface Química Biologia a partir do NIH (2T32GM071339-06A1) (para MED); e subvenções do NIH (1DP2OD002177-01 e NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation e The Bill and Melinda Gates Foundation (a JS).

1. Expressão de Hsp104 <ol><li> O plasmídeo utilizado para a purificação em E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contém o Hsp104 estrutura aberta de leitura sob o controle do promotor induzível trc 26. O plasmídeo produz Hsp104 com um N-terminal Seu 6 tag que pode ser removido por clivagem da protease TEV. PPROEX transformar-HTB-Hsp104 em códon otimizado E. coli BL21-CodonPlus-RIL células (Stratagene, Agilent Technologies) usando um procedimento típico de transformação bacteriana (por exemplo, de acordo com as instruções do fabricante). É importante usar um E. códon otimizado coli cepa Hsp104 porque tem um viés códon incomum. </li><li> Inocular uma cultura 100mL 2XYT (USB. Receita: 16g / L de caseína peptona, 10g / L de extrato de levedura, 5g / L NaCl, pH 7,0) suplementado com ampicilina e cloranfenicol 100μg/mL 34μg/mL com transformantes fresco e crescer durante a noite a 37 ° C com agitação de 200 rpm. </li><li> Inocular 10 ml da cultura durante a noite em 6 X 1L 2XYT com 100μg/mL ampicilina e cloranfenicol 34μg/mL em frascos de 2L. Agite a 250rpm a 37 ° C até OD 600 = ,4-0,6. Parar de tremer e reduzir a temperatura para 15 ° C. Permitem que as células para equilibrar sem agitação por 30min na incubadora até atingir 15 ° C. Uma vez que 15 ° C é atingido induzir a expressão da proteína pela adição de IPTG a uma concentração final de 1mM. Retomar a agitação a 250rpm durante a noite (12-16 horas). </li></ol> 2. Colheita de células e de Lise <ol><li> Células colheita por centrifugação (em um rotor pré-resfriada) a 4.000 rpm por 20min a 4 ° C (usamos um Sorvall RC 3BP centrífuga +). Etapas subseqüentes devem ser realizados imediatamente, porque Hsp104 atividade é diminuída quando E. células coli são congelados. Além disso, todas as etapas subseqüentes devem ser realizados no gelo ou a 4 ° C. </li><li> Ressuspender pellets de células em prechilled (no gelo) 10 ml tampão de lise (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 500mM KCl, 20mM MgCl 2, 2,5% (w / v) de glicerol, 20mM imidazol, 5m pepstatin A, cocktail inibidor da protease completa (1 EDTA sem tablet/50mL), e 2mM β-mercaptoetanol). </li><li> Lisar as células com uma imprensa francesa homogeneizador (Emulsiflex) que usa um trocador de calor imerso em água gelada. Antes da utilização, garantir que todos os aglomerados celulares foram solubilizados. Depois de equilibrar homogeneizador com tampão de lise, duas passagens do cilindro com uma pressão de 15,000-18,000 psi é suficiente para a lise completa. Se uma imprensa francesa não está disponível, a incubação com a lisozima seguido de sonicação pode ser usado (ver discussão). Salvar uma pequena amostra de células lisadas por SDS-PAGE análise (1μL) (Lysate na figura. 2). </li><li> Remover restos celulares por centrifugação a 16.000 rpm por 20min a 4 ° C (usamos um RC5C Sorvall centifuge +). Reter sobrenadante para o próximo passo e salvar uma pequena amostra (1μL) do sobrenadante para análise SDS-PAGE (Ni Load na figura. 2). </li></ol> 3. Purificação Hsp104 <ol><li> Mix sobrenadante do passo 2.4 com 12 ml (2 ml Ni-Sepharose pérolas por 1L de células) de dejetos de 50% de tampão de lise equilibrada Ni Sepharose-beads (GE). </li><li> Rode a amostra lentamente por 3 horas a 4 ° C tal que Ni-Sepharose permanece uniformemente suspensa e espuma é minimizado. Menor tempo de incubação são possíveis, mas vai diminuir o rendimento. A 4 ° C na presença de inibidores de protease, a degradação ocorre pouco, e um tempo de incubação 3 horas Ni Sepharose-não diminui a atividade do produto final. Coletar Ni-Sepharose por centrifugação por 2 min a 4 ° C a 2.000 rpm (Eppendorf 5810R centrífuga). Salvar uma pequena amostra do sobrenadante para análise SDS-PAGE (1μL) e descartar o resto (Ni Flow Through (FT) na figura. 2). </li><li> Lavar os recuperados Ni Sepharose com 25 volumes de coluna de tampão de lavagem (40mm HEPES-KOH pH 7.4, 150mm KCl, 20mM MgCl 2, 2,5% (w / v) de glicerol, 20mM imidazol, 2mM β-mercaptoetanol), 5 volumes da coluna tampão de lavagem com KCl 1M para remover os contaminantes ligados eletrostaticamente para Hsp104, e 25 volumes de coluna de tampão de lavagem. Coletar Ni-Sepharose após cada lavagem por centrifugação por 2 min a 4 ° C a 2.000 rpm (Eppendorf 5810R centrífuga). Após cada ciclo de lavagem e centrifugação, remover tampão por aspiração. </li><li> Para eluir Hsp104, misture Ni-Sepharose com 1mL tampão de eluição (40mm HEPES-KOH pH 7.4, 150mm KCl, 20mM MgCl 2, 2,5% (w / v) de glicerol, imidazol 350mm, 2mM β-mercaptoetanol) por 1 ml Ni-Sepharose e girar a 4 ° C por 20 minutos. A concentração de imidazol alta interrompe o talão Ni-6 Sua interação. Remover Ni-Sepharose com colunas vazias 1,2 mL de rotação (Bio-Rad) por centrifugação por 2 min a 4 ° C a 2.000 rpm (Eppendorf 5810R centrífuga). Salvar 1μL de eluato para análise SDS-PAGE (Ni eluato na figura. 2). Para cada litro de células, ~ 15mg de Hsp104 é obtido nesta etapa. </li><li> Tampão eluído em troca de buffer Q (20mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mM, MgCl 5mM 2, 50 mM NaCl), utilizando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15mL unidades concentrador centrífugo. Primeiro, concentrado protéico de ~ 1,5 ml em seguida, adicione 14.5mL de tampão para diluir proteína Q 10 vezes. Repita 3 vezes para a troca de buffer. O pH aumentou e baixo teor de sal garante que Hsp104 tem uma alta carga negativa. </li><li> Purify Hsp104 através de troca aniônica cromatografia usando um tampão Q equilibrada Resource Q coluna 6ml (GE). Antes da injeção, a proteína é filtrada através de uma baixa ligação protéica Millex GP PES Membrana 0.22μM seringa filtro (Millipore). Nós empregamos uma vazão de 1mL/min. Lavar fracamente proteínas de ligação com 1 volume de tampão de coluna 20% Q + (20mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mM, MgCl 2 5mM, 1M NaCl). Eluir Hsp104 com gradiente linear (20% -50% de buffer Q +) mais de 5 volumes da coluna (Fig. 3). Coletar frações de 1ml. Hsp104 e mais variantes tipicamente eluída no NaCl ~ 400mm (31mS/cm). Salvar amostras de frações de pico (1μL) para análise de SDS-PAGE (Fig. 3, inset). </li><li> Para remover sua 6 tag, proteína de troca utilizando o concentrador Amicon centrífuga como descrito acima (veja o passo 3.5) em tampão de clivagem (20mM HEPES-KOH pH 7.4, 140mm KCl, 10mM MgCl e 2). Use proTEV protease (Promega) ou AcTEV protease (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Para Hsp104, descobrimos que os rácios mais elevados de protease TEV: Hsp104 são necessários para a clivagem completa. Nós usamos uma proporção de 1 unidade de protease por 12μg Hsp104. Clivagem deve ser realizada a 30 ° C por 2-4 horas, seguido de incubação de 16 horas a 4 ° C. Hsp104 concentração final deve ser entre 20-75μM monômero. Destroem qualquer Hsp104 restantes His6-marcadas e protease TEV com Ni-Sepharose (GE), adicionando-Ni Sepharose em excesso para a quantidade de Hsp104 na reação de clivagem (assumir contas pode ligar 15mg de proteína por mL de resina embalado). Remover contas com colunas de spin vazia (Bio-Rad) por centrifugação de 2min a 2.000 rpm a 4 ° C. Coletar amostras antes e depois da clivagem (1μL) para SDS-PAGE análise para garantir clivagem, ea remoção de proteínas uncleaved (Fig. 4). </li><li> Em troca de tamanho do buffer de exclusão (20mM HEPES-KOH pH 7.4, 140mm KCl, 10mM MgCl 2, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT) usando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore), como descrito no passo 3.5. </li><li> Purificar Hsp104 via tamanho-exclusão cromatografia. Use o tamanho do buffer Superose exclusão equilibrado 6 ou Superdex 200 coluna (ambos da GE) (Fig. 5). Antes da injeção, a proteína é filtrada através de uma baixa ligação protéica Millex GP PES Membrana 0.22μM seringa filtro (Millipore). Por menos de 10 mg de proteína, o 10/300 colunas tamanho (24mL) pode ser usado e frações de 0,5 ml são coletados. Para as amostras superiores a 10 mg, a coluna tamanho 12/60 (120ml) deve ser usado e 1 ml frações são coletadas. Consulte as instruções do fabricante para caudais e volumes de amostra a ser carregado. Após purificação, as frações Hsp104 são agrupados conforme mostrado na figura. 5 e concentrada em Unidades Concentrador Amicon centrífugas (Millipore). Hsp104 é armazenado como descrito abaixo. Devido à perda de material em separar Hsp104 produtos de degradação e contaminantes no rendimento final da purificação full-length Hsp104 é ~ 1-3mg por litro de partida cultura. </li></ol> 4. Hsp104 Atividade Disaggregase <ol><li> Após purificação, é uma boa prática para avaliar Hsp104 atividade em um ensaio de desagregação. Normalmente, nós empregamos um ensaio de reativação luciferase 2 (Fig. 6). Neste ensaio, Hsp104 em conjunto com o sistema chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) desagrega-uréia desnaturado agregados luciferase firefly 2. Solúveis luciferase catalisa a oxidação da luciferina para oxiluciferina, uma reação que libera luz. Por luminescência de monitoramento, a reativação relativa, e, portanto, desagregação, da luciferase pode ser determinada. Hsp104 deve ser capaz de sinergicamente colaborar com o sistema de co-chaperone Hsp70. A quantidade de luminescência recuperado depende da Hsp70 exata: par Hsp40 utilizado. Empregamos rotineiramente Hsp72 e Hsp40 (Designs Assay). No mínimo, ativos Hsp104 deve produzir um aumento de 5 vezes na reativação da luciferase, quando comparado à reativação de Hsp72: Hsp40 sozinho (Fig. 6). Hsp104 preparações que não conseguem atingir esse nível de atividade são descartados. </li></ol> 5. Hsp104 Armazenamento <ol><li> De curto prazo de armazenamento, Hsp104 pode ser mantido a 4 ° C em tamanho-exclusão buffer. No entanto, a atividade vai diminuir depois de 2-3 dias a 4 ° C e acentuadamente após uma semana a 4 ° C. Para ensaios de desagregação recomendamos que Hsp104 deve ser usado o mais rapidamente possível após a purificação. Idealmente, Hsp104 deve ser utilizado imediatamente para ensaios de desagregação amilóide. </li><li> Se a proteína deve ser armazenado a longo prazo, Hsp104 é trocada dentro do buffer de armazenamento (20mM HEPES-KOH pH 7.4, 140mm KCl, 10mM MgCl 2, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, glicerol 10% (w / v)). Alíquotas são 100μl pressão congelados em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C. Ciclos de congelamento e descongelamento reduzir drasticamente Hsp104 atividadee deve ser evitado. Recomendamos lentamente descongelamento Hsp104 no gelo. Amilóide disaggregase-atividade irá diminuir drasticamente depois de 1 mês a -80 ° C. </li></ol> 6. Resultados representante e números: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Hsp104 é um disaggregase bifuncional. Desagregação dos agregados desordenado (mostrado à esquerda) requer a cooperação do sistema chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) 2. Remodela Hsp104 ordenou agregados amilóides (mostrado à direita) sem o auxílio de Hsp70 e Hsp40 in vitro, mas Hsp70 e Hsp40 pode melhorar Hsp104 atividade contra amilóide 26,28. Para ambos os tipos de estruturas de agregados, Hsp104 casais hidrólise de ATP a translocação do substrato através de seu canal central para promover a desagregação. Loops tirosina-bearing poros envolver e substrato de transporte através do canal central 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. SDS-PAGE análise de Ni-Sepharose etapa de purificação de afinidade. Lysate, Load Ni, Ni FT e amostras de eluato Ni foram fracionadas por SDS-PAGE usando um 40-20% Tris-HCl 1,0 milímetros Critério de gel (Bio-Rad) e corados Coomassie . Note que nem todos os Hsp104 é capaz de se ligar ao Ni-Sepharose. Ampla Faixa de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) são mostrados (esquerda lane). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Recurso de purificação Q de Ni-Sepharose eluído. Traço azul representa a absorvância a 280nm traço eo verde representa% buffer Q + (máximo de 50%). O primeiro pico, que é eluído em 20% Q + contém impurezas, produtos de degradação e Hsp104 indevidamente dobrado. O segundo pico e os principais contém Hsp104 correctamente dobrados e ativo. Taxa de fluxo foi 1mL/min. Gradiente de 20-50% Q + é de 30 minutos ou 5 volumes da coluna. Detalhe: frações de pico são resolvidos por SDS-PAGE análise usando um 40-20% Tris-HCl 1,0 milímetros Critério de gel (Bio-Rad) e corados Coomassie. Ampla Faixa de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) são mostradas (esquerda). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. SDS-PAGE análise de proTEV etapa de clivagem da protease. Seus 6-Hsp104 de purificação Resource Q foi tratado com proTEV protease durante 4 horas a 30 ° C e 16 horas a 4 ° C. Amostras foram fracionadas por SDS-PAGE usando um 40-20% Tris-HCl 1,0 milímetros Critério de gel (Bio-Rad) e corados Coomassie. Note-se que proTEV clivada Hsp104 migra mais rapidamente. TEV protease e Hsp104 uncleaved foram esgotados com Ni-Sepharose, conforme descrito no Passo 3.7. Ampla Faixa de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) são mostradas (esquerda). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Tamanho-exclusão purificação de Hsp104. Clivadas Hsp104 foi ainda purificada por meio de uma coluna de filtração Superose 6 gel (10/300, GE). = Vazão 0.4ml/min. O pico entre as linhas tracejadas representam frações agrupadas. Detalhe: frações de pico são resolvidos por SDS-PAGE análise usando um 40-20% Tris-HCl 1,0 milímetros Critério de gel (Bio-Rad) e corados Coomassie. Ampla Faixa de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) são mostradas (esquerda). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Ensaio de reativação luciferase. Agregados desnaturadas firefly luciferase (50nm) foram incubadas com um Hsp72 e Hsp40 (1 Hm) (ambos dos projetos Assay), Hsp104 (6μM monômero) ou Hsp104, Hsp72 e Hsp40 de 90min a 25 ° C. Luciferase desnaturado só é totalmente reativado na presença de ambos os Hsp104 e Hsp40/Hsp72. Luminescência recuperado é medida em uma Infinito M1000 Leitor de placa (Tecan). Valores representam médias ± EPM (n = 3).

Não há conflitos de interesse declarados.

Cronograma: Para a atividade Hsp104 máxima recomendamos que o sistema de purificação de todo ser concluída o mais rapidamente possível. No entanto, o número de etapas de purificação torna um calendário exigente, que nem sempre pode ser prático. Se as etapas de purificação são realizadas o mais rapidamente possível, o tempo a partir do final de expressão durante a noite até a 2-4 horas de incubação a 30 ° C com TEV protease é de aproximadamente 9-11 horas. Um lugar potencial para fazer uma pausa está seguindo o pa...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL células competentes </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT caldo </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Completo, mini, EDTA livre inibidor da protease comprimidos </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> A Pepstatin </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Fluxo Rápido </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 centrífuga unidades de filtro (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Resource Q - coluna 6ml </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV Protease </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Designs ensaio </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Designs ensaio </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purificação da hsp104, um disaggregase protein

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 é um hexamérica AAA + 1 proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP para a proteína desagregação 10/02 (Fig. 1). Esta atividade dá dois principais vantagens seletivas. Primeiro, renaturalização de agregados desordenada por Hsp104 capacita sobrevivência levedura após várias proteínas-misfolding salienta, incluindo choque térmico 3,5,11,12. Em segundo lugar, a remodelação das fibrilas de cross-beta-amilóide por Hsp104 permite levedura para explorar prions miríade (amilóides infecciosas) como um reservatório de benéfico e hereditárias variação fenotípica 13-22. Notavelmente, Hsp104 diretamente remodela oligômeros preamyloid e fibrilas amilóides, incluindo aqueles composto de proteínas de levedura prion Sup35 e Ure2 23-30. Esta funcionalidade amilóide remodelação é uma faceta especializados de levedura Hsp104. O E. orthologue coli, ClpB, não oligômeros remodelar preamyloid ou fibrilas amilóides 26,31,32. Orthologues Hsp104 são encontrados em todos os reinos da vida, exceto, perplexidade, os animais. De fato, se as células animais possuem qualquer sistema enzimático que os casais desagregação proteína para renaturalização (ao invés de degradação) permanece desconhecido 33-35. Assim, nós e outros propuseram que Hsp104 pode ser desenvolvido como um agente terapêutico para várias doenças neurodegenerativas relacionadas com o misfolding de proteínas específicas em oligômeros preamyloid tóxicos e fibrilas amilóides 4,7,23,36-38. Não existem tratamentos que visam directamente as espécies agregados associados a estas doenças. No entanto, se dissolve Hsp104 oligômeros tóxicos e fibrilas amilóides composto de alfa-sinucleína, que são conectados com Doença de Parkinson 23, bem como formas de amilóide de PrP 39. Importante, Hsp104 reduz a agregação da proteína e melhora a neurodegeneração em modelos de roedores da doença de Parkinson 23 e doença de Huntington 38. Idealmente, para otimizar o tratamento e minimizar os efeitos colaterais, Hsp104 seria projetado e potencializadas para seletivamente remodelar agregados específicos central para a doença em questão 4,7. No entanto, a limitada compreensão estrutural e mecânica de como Hsp104 desagrega um repertório tão diversificado de estruturas agregadas e proteínas não relacionadas frustra estes esforços 30,40-42. Para compreender a estrutura e mecanismo de Hsp104, é essencial para estudar a proteína pura e reconstituir a sua actividade disaggregase com componentes mínimos. Hsp104 é uma proteína 102kDa com um pI de aproximadamente 5,3, que hexamerizes na presença de ADP ou ATP, ou em concentrações da proteína na ausência de 43-46 nucleotídeos. Aqui, nós descrevemos um protocolo otimizado para a purificação de altamente ativa, Hsp104 estável de E. coli. O uso de E. coli simplificado permite produção em larga escala e nosso método pode ser realizado de forma rápida e confiável para inúmeras Hsp104 variantes. Nosso protocolo aumenta Hsp104 pureza e simplifica a sua remoção 6 tag em comparação com um método de purificação prévia do E. coli 47. Além disso, o nosso protocolo é mais fácil e conveniente do que dois protocolos mais recentes 26,48.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de afinidade<em&gt; E. coli</em&gt; Seguido de cromatografia de troca aniônica, His6 tag-remoção com protease TEV e tamanho-exclusão cromatografia.

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

A Hsp104 é uma proteína AAA+ hexamérica1 de levedura, que acopla a hidrólise de ATP à desagregação de proteínas2-10 (Fig. 1). Essa atividade confere duas características fundamentais...

O objetivo geral deste procedimento é produzir grandes quantidades da proteína HSP 1 0 4 A altamente ativa para desagregação. Isso é realizado primeiramente expressando a HSP 1 0 4 em códons em células de e coli otimizadas. A proteína HS P 1 0 4 é então purificada por meio de uma marca de afinidade por histidina, seguida por uma coluna de troca iônica.Após a cromatografia de troca iônica. A clivagem da marcação de histidina é realizada utilizando a protease TEV. O passo final de purificação consiste em passar a proteína HSP 1 0 4 clivada por uma coluna de filtração em gel.Além disso, o ensaio de reativação de Elif é usado para determinar se a HSP 1 0 4 ativa foi purificada. A principal vantagem dessa técnica em relação aos protocolos existentes é o pequeno número de etapas aliado ao alto rendimento de HSP 1 0 4 altamente ativa, adequada para estudos estruturais e mecanicistas. Pessoas novas nesse método podem ter dificuldades, pois a maioria das etapas de purificação ocorre em um único dia, resultando em uma agenda exigente.Antes de iniciar este protocolo, prepare todos os tampões necessários para a purificação da HSP 1 0 4 conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Além disso, expresse a proteína HSP 1 0 4 durante a noite em e coli seguindo o procedimento detalhado no texto; após a expressão, recolha as células por centrifugação. Re-suspenda os pellets celulares em 10 mililitros de tampão de lise pré-resfriado antes da lise celular utilizando um homogeneizador de prensa francesa, garantindo que todos os agregados celulares tenham sido solubilizados. Após equilibrar o homogeneizador com o tampão de lise, lise as células com duas passagens pelo cilindro.Em uma pressão de 15.000 a 18.000 PS, removo os detritos celulares por centrifugação e mantenho o sobrenadante para a purificação contínua. Inicie a purificação da HSP 1 0 4 misturando o sobrenadante com uma suspensão a 50% de tampão de lise equilibrado em níquel SRO speeds. Incube a amostra em rotação lenta durante três horas a quatro graus Celsius, de modo que as esferas permaneçam uniformemente suspensas e a formação de espuma seja minimizada.Após a incubação, colete os esferos de níquel por centrifugação. Lave os esferos de níquel recuperados com 25 volumes de coluna do tampão de lavagem. Recolha novamente as microesferas por centrifugação, após o que o tampão de lavagem pode ser removido por aspiração.Em seguida, lave as esferas com cinco volumes da coluna de tampão de lavagem contendo um molar de cloreto de potássio, seguido por 25 volumes da coluna de tampão de lavagem. Para eluir a HSP 1 0 4, misture as esferas de níquel com o tampão de eluição e incube em rotação a quatro graus Celsius por 20 minutos.Se pare as esferas do eluato por centrifugação através de colunas vazias de 1,2 mililitro. Centrifugue as colunas. Cada litro de células produz cerca de 15 miligramas de HSB 1 0 4.Neste ponto da purificação, concentre o eluato até aproximadamente 1,5 mililitro utilizando um concentrador centrífugo com corte de peso molecular de 30.000. Em seguida, adicione 14,5 mililitros do tampão Q para diluir a proteína dez vezes.Repita este processo três vezes para tamponar. Troque a proteína antes da purificação da HSP 1 0 4 por meio de cromatografia de troca iônica. Filtre a proteína através de um filtro de seringa de baixa ligação proteica de 0,22 micrometros.Em seguida, injete a proteína em uma coluna de 6 mililitros equilibrada com tampão Q. Lave as proteínas de ligação fraca com um volume da coluna de 20% do tampão B e elua a HSB 1 0 4 com um gradiente linear ao longo de cinco volumes da coluna, coletando frações de um mililitro. A HSB 1 0 4 e a maioria das variantes normalmente eluem em torno de 400 milimolares de cloreto de sódio. Para remover a marcação hexa-histidina, troque a proteína utilizando um concentrador centrífugo e clive a marcação com a protease TEV de acordo com as instruções do fabricante.Realize a clivagem a 30 graus Celsius por duas a quatro horas, seguida por uma incubação de 16 horas a quatro graus Celsius. Deplete qualquer HSB 1 0 4 marcado com hexa-histidina e protease TEV remanescente com SROs de níquel, adicionando as perlas em excesso em relação à quantidade de HSP 1 0 4 na reação de clivagem. Em seguida, remova as perlas da amostra por centrifugação através de colunas de giro vazias.Para se preparar para a etapa final de purificação, troque a proteína para o tampão de exclusão por tamanho utilizando um filtro centrífugo com limite de peso molecular de 30.000, após filtração por um filtro de seringa com baixa ligação a proteínas de 0,22 micromolar. Purifique ainda mais a HSP 1 0 4 por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando um tampão de exclusão por tamanho.Coluna super oh seis equilibrada. Realize a corrida de FPLC de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação, colete as frações de HSP 1 0 4 e concentre-as em unidades concentradoras centrífugas devido à perda de material durante a separação dos produtos de degradação e contaminantes da HSP 1 0 4; o rendimento final da HSP 1 0 4 purificada de comprimento completo é de aproximadamente um a três miligramas por litro de cultura inicial.É mostrada aqui a análise por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS da purificação por afinidade em níquel. A proteína HSP 1 0 4 com marcação de histidina de 105 quilodaltons é visível em amostras obtidas do lisado, da carga nas esferas, do fluxo passante das esferas e da eluição das esferas. Observe que nem toda a HSP 1 0 4 é capaz de se ligar ao níquel; a cromatografia de afinidade em níquel é seguida por troca iônica em uma coluna Resource Q.O traço azul representa a absorbância a 280 nanômetros e o traço verde representa a porcentagem do tampão B. O primeiro pico, que elui a 20% de B, contém produtos de degradação e impurezas, bem como HSP 1 0 4 incorretamente dobrada. O pico principal contém HSP 1 0 4 corretamente dobrada e ativa, conforme indicado pela análise em gel de SDS-PAGE após troca iônica. A proteína HEXA histamina HSP 1 0 4 está sujeita à clivagem da marcação his por clivagem com a protease pro TV.Observe que a HSP 1 0 4 clivada pelo prot v migra mais rapidamente do que a proteína marcada com hexa-histidina. A HSP 1 0 4 clivada foi então submetida a uma purificação adicional por meio de uma coluna de filtração em gel AUP O seis. O pico entre as linhas tracejadas representa as frações reunidas.Mostrados aqui estão os resultados do ensaio de reativação da luciferase, que é usado para avaliar a atividade de desagregação da HSP 1 0 4. Agregados de luciferase de vaga-lume desnaturada foram incubados com HSP 40 e HSP 72, HSB 1 0 4 ou HSP 1 0 4, HSP 40 e HSB 72. A luciferase desnaturada só é totalmente reativada na presença de HSP 1 0 4, bem como de HSP 40 e HSP 72, conforme evidenciado pelo grande aumento na luminiscência. Uma vez dominado, este protocolo pode ser realizado em dois dias se for executado corretamente.

purification-of-hsp104-a-protein-disaggregase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um romance e altamente eficiente em duas etapas cromatografia de afinidade protocolo foi desenvolvido e é descrita em detalhes. O método é baseado em uma tag de purificação com duas pequenas afinidades inerentes e é aplicável a uma grande variedade de proteínas-alvo com propriedades diferentes.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Fonte: Murata, T., et al. Purificação de uma proteína de alta massa molecular em Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina secretada por Streptococcus mutans.

Um procedimento para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina de Streptococcus mutans

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para...

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Os modelos de proteinopatia de levedura são ferramentas valiosas para avaliar a toxicidade e a agregação de proteínas implicadas na doença. Aqui, apresentamos métodos para triagem de bibliotecas de variantes de Hsp104 para supressores de toxicidade. Este protocolo pode ser adaptado para rastrear qualquer biblioteca de proteínas em busca de supressores de toxicidade de qualquer proteína tóxica em leveduras.

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de monômeros nativos, livre de marca e fibrilas do exon1 da proteína huntingtina (Httex1) com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO).

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Aprenda a purificar a Hsp104, uma disaggregase proteica AAA+ hexamérica de levedura, usando cromatografia de afinidade, troca iônica e exclusão molecular. Este método produz proteína altamente ativa para estudos estruturais e funcionais.

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Explorar mais vídeos