Injeção sub-retiniana de vetores virais no epitélio pigmentar da retina em um modelo de camundongo

Comece com um camundongo anestesiado e aplique um agente dilatador da pupila.

Sob um microscópio, abra a pálpebra e projete ligeiramente o olho para expor o local da injeção.

Aplique uma gota de solução viscoelástica oftálmica e, em seguida, coloque uma lamínula para visualizar a retina.

Usando uma agulha fina, crie um orifício atrás da junção córnea-esclera, evitando danos aos vasos sanguíneos e ao cristalino.

Através deste orifício pré-perfurado, insira uma seringa romba tangencialmente no espaço sub-retiniano próximo ao epitélio pigmentar da retina ou EPR, que suporta os neurônios da retina.

Injete o vetor lentiviral que transporta genes-alvo no espaço sub-retiniano.

Observe a formação de uma bolha sub-retiniana devido ao acúmulo de líquido, confirmando a entrega bem-sucedida do vetor.

Feche suavemente a pálpebra para cobrir o local da injeção e permitir que o mouse se recupere.

O lentivírus entra no EPR por endocitose, libera seu material genético e o converte no DNA correspondente, que se integra ao genoma do hospedeiro, permitindo a expressão gênica.

Primeiro, prepare uma seringa de microlitro com uma agulha romba de calibre 33. Esterilize-o usando gás óxido de etileno. Em seguida, prepare uma diluição dos vetores virais em PBS em um tubo de micro fuge a cerca de 1 milhão de unidades de título por microlitro. Agora, ao carregar a seringa, lave-a várias vezes com a solução para remover qualquer espaço morto na seringa. Prepare 1,5 a 2 microlitros para injetar.

Com a injeção de vetor viral preparada, anestesiar um camundongo adulto com uma injeção intraperitoneal de tiletamina, zolazepam e xilazina. Confirme se o animal foi anestesiado pela ausência de reflexos. Uma vez confirmada a anestesia, dilate suas pupilas com uma gota de fenilefrina a 0,5% e tropicamida a 0,5%. Agora, sob um microscópio cirúrgico, abra a pálpebra e projete o olho para expor o equador. Mantenha o olho nesta posição colocando os dedos fora da borda orbital.

Em seguida, aplique a solução viscoelástica oftálmica na superfície da córnea e coloque uma pequena lâmina de cobertura redonda sobre a córnea. Assim, a retina pode ser visualizada. Agora, ligeiramente posterior ao limbo e inferiormente no olho direito, ou superiormente no olho esquerdo, use uma meia agulha estéril de calibre 30 para fazer um pequeno orifício. Orifícios colocados temporariamente ou nasalmente não são boas escolhas, pois são difíceis de cobrir.

Durante a punção, não bata no vaso límbico ou na lente e não insira todo o chanfro da agulha.

Para as injeções sub-retinianas, insira a agulha de injeção vetorial através do orifício em um ângulo de 45 graus em relação ao plano da íris. Empurre a agulha posteriormente em direção à área peripapilar, seguindo o caminho demarcado para cruzar a cavidade vítrea. Aproxime a agulha no espaço sub-retiniano até sentir uma leve resistência, o que indica que a camada de EPR foi atingida.

Não penetre no tecido escleral com pressão excessiva, pois a agulha deve ser colocada no espaço sub-retiniano potencial. Se a agulha perfurar o tecido do crânio com força excessiva, ela entra no espaço orbital extraocular sem resistência.

Agora, injete suavemente o vetor viral no espaço sub-retiniano. Mantenha a agulha bem imóvel para evitar danos aos tecidos, o que é de vital importância. Em seguida, retire a agulha com a mesma delicadeza. Agora, o globo ocular pode ser liberado. O sangramento sub-retiniano indicativo de acúmulo de vetor deve ser visível. Por fim, feche suavemente a pálpebra para cobrir o local da injeção. A auto-vedação do orifício ocorrerá.