Name: Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a purificar ribossomos de levedura altamente ativos usando cromatografia com coluna SFO link carregada com cisteína. Este método remove nucleases e proteases, garantindo ribossomos intactos para análises bioquímicas e estruturais confiáveis.

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Queremos agradecer a todos os membros do laboratório Dinman, incluindo Ashton Belew, Jack Karen, Musalga Sharmishtha, Sulima Sergey, Reddy Shivani, e Michael Rhodin pela sua ajuda e de entrada neste projeto. Este trabalho foi suportado por concessões de AM da American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD do National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL foi apoiada por um americano e Reinvestimento Lei de Recuperação de 2009 suplemento para a concessão dos pais (3R01GM058859-11S1).

1. Preparação de uma cisteína cobrado Sulfolink resina <ol><li> Prepare Sulfolink resina (Pierce) em temperatura ambiente. </li><li> Lugar um total de 10 ml de uma suspensão de 50% dos Sulfolink gel de acoplamento, conforme fornecido pelo fabricante em dois frascos de 10 ml de plástico, com 5 ml distribuídos em cada frasco. </li><li> Brevemente frascos de centrífuga a 850 xg e remova cuidadosamente sobrenadantes. </li><li> Lave o gel três vezes em tampão de acoplamento (50 mM Tris, pH 8.5, 5 mM EDTA) pela ressuspensão as contas em 5 ml, centrifugação a 850 xg brevemente e remover o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Adicione cinco ml de uma solução 50 mM de L-cisteína em tampão de acoplamento em cada tubo e misture a polpa de 1 hora a 25 ° C. </li><li> Remover o residual L-cisteína por lavagem como descrito no passo 1.4 acima. </li><li> Ressuspender o gel em 10 ml de tampão de ligação [20 mM HEPES, pH 7.6, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT], e equilibrar a resina pela lavagem em 10 ml de tampão de ligação3 vezes como descrito no passo 1.4. Decantar resina em uma centrífuga de 10 ml coluna tampa, e armazenados a 4 ° C. A capacidade de resina para RNA ligação é ~ 20 A 260 unidades por ml. </li></ol> 2. Purificação cromatográfica dos ribossomos usando uma cisteína cobrado Sulfolink resina Nota: Se estiver trabalhando com uma cepa em que a atividade protease prova ser um problema, cocktails da inibição da protease pode ser usado em todos os buffers subseqüentes. <ol><li> Manter todos os componentes no gelo e preparar todas as soluções usando RNase água e filtração estéril. </li><li> Cultivar células de levedura durante a noite para meados log-fase (OD 595 = 0,6-1,2) em mídia apropriada. Pellet células por centrifugação, e lavar as células 1 grama em tampão de ligação e centrifugar a 3700 xg por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de tampão de ligação a um volume total aproximado de 2 ml, e interromper usando um volume igual de 0,5 milímetros contas de vidro refrigerados a 4 ° C ucantar uma Biospec Mini-bead beater (Bartlesville, OK). Amostras podem ser divididos em tubos múltiplos, conforme necessário. </li><li> Remove as células intactas, organelas, e os restos celulares por centrifugação a 30.000 xg por 30 minutos em uma Optima Max Beckman-Coulter ultracentrífuga E (Fullerton, CA). </li><li> Imediatamente antes da utilização, pellet da resina por um minuto a 1.000 xg para remover a solução de armazenamento. Dois ml de resina é usada para cada grama de células. </li><li> Remover sobrenadantes lisado celular a partir do spin-xg 30.000 (S30), tendo o cuidado de minimizar a contaminação tanto da fração lipídica no topo ou os restos de células na parte inferior dos tubos, e coloque diretamente na pasta Sulfolink cobrado. A camada lipídica podem ser evitados tanto por remoção ou empurrando para fora da pipeta após o ponta cruzou para o sobrenadante. </li><li> Incubar a mistura S30/Sulfolink no gelo sem misturar por 15 minutos. </li><li> Coloque as colunas em tubos cônicos de 15 ml e centrifugar a 1000 xg porr de um minuto. </li><li> Coloque as frações fluxo contínuo de volta para as colunas, misture com a mão, e incubar por mais 15 minutos no gelo. </li><li> Coloque as colunas em tubos cônicos de 15 ml e centrifugar a 1000 xg durante um minuto. Descartar o fluxo contínuo. </li><li> Cap colunas e adicionar 5 ml de tampão de ligação. Mix colunas à mão até ressuspenso, remover as tampas, e centrifugar a centrífuga a 1.000 xg colunas durante um minuto. Repita este protocolo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Adicionar 1,5 ml de tampão de eluição (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2mM DTT, 0,5 mg / ml de heparina) para cada coluna. Mix de suspensões por mão, e incubar no gelo por 2 minutos </li><li> Colunas lugar em novos tubos de 15 ml cônico e centrifugar a 1000 xg por 1 minuto. Coletar eluído. Repita o passo de eluição mais uma vez para que o final de volumes de amostra são combinados ~ 3 ml. Resina utilizada pode ser lavado com tampão de eluição sem heparina e seguida de equilíbrio com Buffe vinculativor, e armazenados em volumes de 10 ml de tampão de ligação a 4 ° C para reutilização posterior. </li></ol> 3. Tratamento puromicina Nota: Um método alternativo para remover contaminantes espécies tRNA é mudar a partir de uma glucose ricos em mídia de glicose esgotados para promover o escoamento ribossomo. No entanto, isso muda o estado metabólico das células de levedura, o que poderia afetar a função do ribossomo e concentração. , A fim de strip os ribossomos a partir endógena peptidil-tRNA, um tratamento com puromicina é executada. <ol><li> Neutralize a solução de pH 7,5 puromicina 100 mM KOH 1M, adicionando gota a gota à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar solução puromicina neutralizado para ~ concentração 1mM final no eluído. </li><li> Adicionar 100 mM GTP para uma concentração final de 1 mM. </li><li> Incubar por 30 minutos a 30 ° C. </li></ol> 4. Purificação dos ribossomos por sedimentação através de coxins de glicerol <ol><li> Coloque um mlalmofada de tampão (20 mM HEPES, pH 7.6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, glicerol 25%) em um tubo de volume 4 ml ultracentrífuga policarbonato. </li><li> Suavemente camada puromicina tratados frações de eluição em cima da almofada, e amostras de centrifugação a 100.000 xg durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover os tubos do rotor de centrífuga, e aspire sobrenadantes. </li><li> Lavar pellets contendo ribossomos purificada duas vezes com 1 ml de tampão almofada. </li><li> Ressuspender ribossomos em 100 l de tampão almofada pela ruptura suave usando uma vareta de vidro. </li><li> Após interrupção, cobrir os tubos com parafilme e agite a uma velocidade moderada em um vórtice sala fria durante uma hora. </li><li> Transferir o conteúdo para um tubo de microcentrífuga, centrífuga por 5 minutos na velocidade máxima a 4 ° C, e remover sobrenadante para tubos fresco. </li><li> Repita os passos de 4,1-4,7 utilizando 2 ml de tampão almofada e, exceto pelo fato de 100 mL de buffer de armazenamento (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, glicerol 25%) é usado em passos 4.4 e 4.5 ao invés de tampão almofada. </li><li> Quantificar os ribossomos purificada espectrofotometricamente (1 A 260 = 20 pmoles dos ribossomos de levedura), e armazenar a -80 ° C. Os resultados típicos a partir de 1 grama de levedura são 300-400 pmoles dos ribossomos. </li></ol> 5. Resultados representativos: Um exemplo de espécies de RNA extraído de cada uma das três etapas principais do protocolo é mostrado na Figura 2. Enquanto rRNAs são as principais espécies presentes em lisados ​​celulares total (T) estes também contêm um grande número de outras espécies de RNA. Ribossomos purificada a partir da coluna Sulfolink (SL) também contêm uma grande quantidade de tRNAs devido à alta afinidade da cama coluna para estas espécies também. Tratamento desta fração com resultados puromicina na hidrólise de peptídeos de peptidil-tRNAs, e promove a dissociação dessas espécies de ribossomos. A puromicina amostras tratadas falta (Pm) co-purifyinespécies g tRNA, e, portanto, representam ribossomos completamente puro. Como relatado anteriormente 8, essas ribossomos são altamente intacta e bioquimicamente ativas, tornando-os ideais para substratos detalhadas análises funcionais e estruturais. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do método. Purificação cromatográfica dos ribossomos usando a cisteína ligados sulfolink resina é retratado. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análise representativa das preparações ribossomo. Espécies de RNA total foram extraídas de lisados ​​celulares total (T), ribossomos Sulfolink purificada (SL) e Sulfolink purificada ribossomos posteriormente tratados com puromicina e sedimentada através de uma almofada de glicerol (Pm). Pista M representa marcadores de tamanho RNA. Bandas representando rRNAs 25S e 18S, bem como tRNAs e outras espécies de RNA são indicados. Todospistas foram carregados com 2 mg de RNA.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Protocolos de purificação de ribossomo basicamente envolvem as células de lise, colhendo uma fração citosólica de uma rotação baixa velocidade, e depois de granulação ribossomos por centrifugação de alta velocidade 1. Enquanto uma novela poucos métodos têm sido utilizados para a purificação ribossomos bacterianos, o mesmo não tinha sido verdade para eucariontes 2-4. Embora as etapas foram adicionadas ao longo dos anos, lava o sal por exemplo, almofadas e glicerol (por exemplo, ver 5), es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sulfolink resina Coupling </td><td> Perfurar </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini-bead beater 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max ultracentrífuga E </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legenda RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 milímetros Contas de vidro </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

purificação cromatográfica de ribossomos yeast highly active

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Ribossomos eucarióticos são muito mais instável, em comparação com os seus homólogos eubacterianas archael e, desta forma criando um grande desafio para os pesquisadores. Particularmente problemático é o fato de que a lise de células libera um grande número de proteases e nucleases que podem degradar os ribossomos. Assim, é importante separar os ribossomos a partir destas enzimas o mais rápido possível. Infelizmente, os métodos convencionais ultracentrifugação diferencial deixa ribossomos expostos a estas enzimas por períodos inaceitavelmente longos de tempo, afetando sua integridade estrutural e funcionalidade. Para resolver este problema, nós utilizamos um método de cromatografia usando uma cisteína cobrado Sulfolink resina. Esta aplicação simples e rápido reduz significativamente co purificação de atividades proteolíticas e nucleolytic, produzindo altos rendimentos de intacto, ribossomos de levedura altamente bioquimicamente ativas. Sugerimos que este método também deve ser aplicável a ribossomos de mamíferos. A simplicidade deo método ea pureza maior e atividade do ribossomo purificada cromatograficamente representa um avanço técnico significativo para o estudo dos ribossomos eucarióticos.

Contaminação de preparações dos ribossomos eucarióticos purificado por métodos tradicionais de co purificação de proteases e nucleases negativamente impactos sobre a jusante análises bioquímicas e estruturais. Um método de purificação cromatográfica rápida e simples é usado para resolver esse problema usando os ribossomos de levedura como um sistema modelo.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Os ribossomos eucarióticos são muito mais lábeis em comparação com os seus correspondentes eubacterianos e arqueanos, representando, portanto, um desafio significativo para os pesquisadores. ...

O objetivo geral deste procedimento é purificar ribossomos de levedura intactos e altamente ativos. Isso é realizado primeiramente lisando as células e clarificando o lisado por centrifugação de alta velocidade. Para obter a fração S 30, uma coluna com ligante SFO carregada com cisteína é então utilizada para purificar os ribossomos.Em seguida, realiza-se a remoção de tRNAs contaminantes com tratamento com puromicina como etapa final de purificação. Os ribossomos são submetidos à ultracentrifugação em alta velocidade. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a purificação por ultracentrifugação, é que o uso da coluna sulfa link separa rapidamente os ribossomos de exonucleases e proteases contaminantes.Além disso, a etapa de tratamento com puromicina separa os ribossomos de espécies de RNA contaminantes, como os RNAt. Essas etapas garantem a produção de grandes quantidades de ribossomos purificados altamente ativos e intactos, para uso em estudos bioquímicos e estruturais. O procedimento será demonstrado por Jonathan Leschen, pesquisador associado pós-doutorando do meu laboratório.Inicie este protocolo pipetando uma suspensão a 50% de gel de sulfa link para acoplamento, conforme fornecido pelo fabricante, em dois frascos plásticos de 10 mililitros, distribuindo cinco mililitros em cada frasco. Após centrifugar brevemente os frascos a 850 ×g, remova cuidadosamente os sobrenadantes. Lave o gel três vezes com tampão de acoplamento, ressuspendendo as microesferas em cinco mililitros, e em seguida centrifugue brevemente a 850 ×g. Remova o sobrenadante com pipeta. Após a lavagem da resina, adicione cinco mililitros de uma solução de 50 milimolares de L-cisteína em tampão de acoplamento a cada tubo.Agite a suspensão durante uma hora a 25 graus Celsius. Em seguida, remova a L-cisteína residual lavando a resina três vezes com tampão de acoplamento puro. A seguir, re-suspenda o gel em 10 mililitros de tampão de ligação e equilibre a resina lavando-a três vezes.Por fim, decante a resina para uma coluna de centrifugação de 10 mililitros e tampe-a. A resina pode ser armazenada a quatro graus Celsius e possui uma capacidade de resina de aproximadamente 20 a duas unidades 60 por mililitro durante a purificação cromatográfica de ribossomos. Utilizando uma resina de sulfa link carregada com cisteína.Mantenha todos os componentes em gelo e prepare todas as soluções usando água livre de RNAses e filtração estéril. Cultive células de levedura durante a noite até a fase logarítmica média no meio apropriado. Após pelotizar as células por centrifugação, lave um grama de células em tampão de ligação e centrifugue novamente, depois ressuspenda as células em um mililitro de tampão de ligação para um volume total aproximado de dois mililitros.Disrupte as células usando um volume igual de esferas de vidro de 0,5 milímetro resfriadas a quatro graus Celsius, bem como um mini agitador de esferas. Remova as células não rompidas, organelas e detritos celulares por centrifugação a 30.000 vezes G durante 30 minutos em uma ultracentrífuga. Enquanto isso, pelote a resina por um minuto a 1.000 vezes G. Para remover a solução de armazenamento imediatamente antes do uso.Utilizam-se dois mililitros de resina para cada um grama de células. Após a ultracentrifugação das amostras, remova os sobrenadantes do lisado celular do giro a 30.000 vezes G, denominado S 30. Tenha cuidado para minimizar a contaminação pela fração lipídica na parte superior ou pelos detritos celulares na parte inferior dos tubos.Transfira os sobrenadantes diretamente para a suspensão carregada de SFO link. Incube a mistura de S 30 SFO link em gelo por 15 minutos. Coloque as colunas em tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 1000 vezes G por um minuto, transfira as frações do fluxo passante de volta para as colunas, tampe as colunas e inverta-as para homogeneizar.Incube as amostras por mais 15 minutos em gelo. Em seguida, coloque as colunas em tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 1000 ×g por um minuto, descartando o fluxo inicial. Após adicionar cinco mililitros de tampão de ligação, tampe as colunas e inverta para misturar até completa ressuspensão.Retire as tampas e centrifugue as colunas a 1000 vezes G durante um minuto. Repita este protocolo de lavagem mais duas vezes. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão de eluição a cada coluna.Misture as suspensões manualmente e incube em gelo por dois minutos. Como etapa final, coloque as colunas em novos tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 1000 vezes G durante um minuto, recolha o eluato e repita a etapa de eluição mais uma vez, de modo que os volumes finais combinados das amostras sejam aproximadamente três mililitros. Para remover os ribossomos do peptídeo endógeno, realiza-se o tratamento com T-R-N-A-A com puromicina.Primeiro, neutralize uma solução de pur micina a 100 milimolar até pH 7,5 adicionando hidróxido de potássio 1 molar gota a gota. Adicione à temperatura ambiente. Adicione a solução de pur micina neutralizada até uma concentração final aproximada de um milimolar no eluato.Em seguida, adicione GTP 100 milimolar para obter uma concentração final de um milimolar. Incube a mistura por 30 minutos a 30 graus Celsius. Após a incubação, coloque um mililitro de tampão de amortecimento em um tubo de ultracentrífuga de poliacabornato com volume de quatro mililitros.Cubra suavemente as frações de eluição tratadas com puromicina sobre o amortecedor e centrifugue as amostras a 100.000 vezes G durante a noite. Após aspirar os sobrenadantes, lave os pellets contendo os ribossomos purificados com um mililitro de tampão de amortecimento. Repita essa lavagem com um segundo mililitro de tampão de amortecimento.Em seguida, Reza suspendeu os ribossomos em 100 microlitros de tampão de amortecimento mediante disruptura suave com uma haste de vidro. A seguir, cubra os tubos com parafina e agite em velocidade moderada em um vórtex de câmara fria. Após uma hora de agitação, transfira o conteúdo para um tubo de microcentrífuga e centrifugue por cinco minutos em velocidade máxima a quatro graus Celsius.Transfira os sobrenadantes para tubos novos. Deponha os sobrenadantes sobre dois mililitros de tampão de amortecimento em um tubo de ultracentrífuga, seguido por centrifugação a 100.000 × g durante a noite. No dia seguinte, retire os tubos do rotor da centrífuga e aspire os sobrenadantes.Utilizando o método recém-descrito, lave os pellets e re-suspenda os ribossomos com tampão de armazenamento. Por fim, quantifique os ribossomos purificados espectrofotometricamente antes de armazenar a menos 80 graus Celsius.É mostrado aqui um exemplo de espécies de RNA extraídas de cada uma das três etapas principais do protocolo, incluindo os lisados celulares totais, os ribossomos purificados por sulf olink, e os ribossomos purificados por sufu link subsequentemente tratados com pur micina e sedimentados através de uma camada de glicerol. Também são mostrados marcadores de tamanho de RNA, enquanto os nossos RNAs são as espécies majoritárias presentes nos lisados celulares totais. Estes também contêm um grande número de outras espécies de RNA.Os ribossomos purificados da coluna de ligação sulfa contêm uma grande quantidade de RNAts devido à alta afinidade do leito da coluna por essas espécies. O tratamento dessa fração com piro micina resulta na hidrólise de peptídeos de RNAts peptidil, e promove a dissociação dessas espécies dos ribossomos. As amostras tratadas com micina pura não possuem espécies de RNAt copurificadas e, portanto, representam ribossomos completamente puros.Como relatado anteriormente, esses ribossomos são altamente intactos e bioquimicamente ativos, tornando-os substratos ideais para análises funcionais e estruturais detalhadas. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios para monitorar a ligação de ligantes aos ribossomos e análises estruturais, podem ser realizados com o objetivo de responder perguntas adicionais, tais como: quais são as propriedades bioquímicas e biofísicas dos ribossomos eucarióticos.

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Nós descrevemos um método rápido e eficaz para a purificação de mitocôndrias da...

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução...

 Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Aqui nós apresentamos um protocolo para expressar, solubilizar e purificar vários transportadores de borato eucarióticas com homologia à família de transportador de SLC4 usando o fermento. Também descrevemos um ensaio químico do cross-linking para avaliar as proteínas homomeric purificado para assembly multiméricas. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas de membrana desafiador.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a expressão, purificação e ligação liposoma de heterodimers SNX-BAR em levedura.

Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento

Apresentamos um método rápido e econômico para produzir o sistema TX-TL sem células PURE recombinante usando equipamentos de laboratório padrão.

Sistema sem células OnePot PURE

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Este protocolo apresenta um método de isolamento de cromatina locus-específico baseado em recombinação sítio-específica para purificar um locus gênico de cópia única de interesse em seu contexto de cromatina nativa a partir de levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae.

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a purificar ribossomos de levedura altamente ativos usando cromatografia com coluna SFO link carregada com cisteína. Este método remove nucleases e proteases, garantindo ribossomos intactos para análises bioquímicas e estruturais confiáveis.

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

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