Desenvolvimento de um Unilateralmente-lesionadas modelo de rato 6-OHDA da Doença de Parkinson

O objetivo geral deste procedimento é gerar um modelo murino de parkinsonismo. Isso é realizado primeiramente preparando as drogas para a cirurgia. O próximo passo é montar o aparelho cirúrgico, em seguida é realizada a cirurgia de lesão unilateral com seis hidroxi dopamina, seguida dos cuidados pós-operatórios adequados.

Os animais lesionados com seis hidroxidopamina podem ser usados para experimentos comportamentais. Em última análise, os resultados mostram uma redução de dopamina superior a 95% no feixe medial de quatro fibras cerebrais unilateralmente. Os dois aspectos mais importantes deste procedimento aos quais os indivíduos devem prestar atenção são, em primeiro lugar, os cuidados pós-operatórios adequados para garantir a sobrevivência dos animais.

Em segundo lugar, cuidado com a preparação do equipamento para infusão de seis hidroxidopamina para garantir que a administração da neurotoxina seja completa. Para iniciar este procedimento, esterilize os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave. Em seguida, limpe todas as superfícies e equipamentos com álcool isopropílico.

Em seguida, prepare a recuperação pós-cirúrgica montando uma gaiola de recuperação para camundongo com toalhas de papel na base. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento ou sobre um tapete aquecido para montar o carrinho de anestesia. Certifique-se de que o fluxo de oxigênio esteja conectado e aberto, e de que o reservatório de isoflurano esteja completamente cheio.

Depois disso, ajuste o fluxo de oxigênio para 1% e o isoflurano para 2 a 4%. O próximo passo é montar o aparelho de infusão. Encaixe uma porca metálica RN em um dos lados do tubo peak, seguido pelo copo peak feral. Em seguida, posicione o feral PFA canônico de modo que o cone no feral PPFA canônico se encaixe na parte correspondente do copo peak feral.

Em seguida, posicione o copo do pico acoplado e o PFA canônico feral em cada extremidade do acoplador RN de duplo hub pequeno e aperte a porca metálica RN na outra extremidade do acoplador RN de duplo hub pequeno. Insira uma agulha de injeção de 33 gauge. Passe a agulha através de uma das porcas metálicas RN e aperte-a.

Certifique-se de que a agulha de calibre 33 esteja em um ângulo de 180 graus em relação ao acoplador RN de duplo pequeno eixo. Em seguida, na outra extremidade do tubo do pico, encaixe uma das porcas metálicas RN seguida por um copo pico feral. Depois, posicione o feral PFA padrão na ranhura mais profunda do segundo acoplador RN de duplo pequeno eixo e aperte a porca metálica RN para fixar a conexão.

Em seguida, na outra extremidade do segundo acoplador duplo pequeno do hub RN, insira a isca no adaptador pequeno do hub RN e aperte a porca metálica RN da isca para fixar a conexão. A montagem do aparelho de infusão está agora concluída. Outro passo preparatório é escorar o aparelho de infusão.

Primeiro, encha as seringas Hamilton de 250 microlitros e um microlitro com água estéril. Certifique-se de que não haja bolhas de ar. Em seguida, acople a seringa de 250 microlitros ao adaptador de isca e pressione o êmbolo da seringa de 250 microlitros para que a água seja liberada através da agulha de injeção 33 gauge na outra extremidade da tubulação.

Continue empurrando a água pelo sistema enquanto retira a seringa de 250 microlitros do adaptador de isca. Deixando uma pequena gota de água na extremidade do adaptador de isca, pressione o êmbolo da seringa de um microlitro até que uma pequena gota de água seja expelida. Em seguida, insira cuidadosamente a seringa de um microlitro no adaptador de isca.

Certifique-se de que a gota de água na seringa de um microlitro entre em contato com a gota de água no adaptador de isca. Em seguida, insira completamente a seringa de um microlitro no adaptador de isca e verifique se não há bolhas no pequeno acoplador duplo do tipo RN. Agora, fixe o aparelho de perfusão ao estereotáxico e prenda o acoplador duplo pequeno do tipo RN com a agulha de injeção de calibre 33 no braço do manipulador do estereotáxico.

Em seguida, fixe a seringa de um microlitro na bomba de perfusão. Depois disso, programe a bomba de infusão para permitir uma taxa de infusão de 0,1 microlitro por minuto, 30 minutos antes da operação. Pese o animal e registre seu peso.

Administre uma mistura de 2,5 miligramas por mililitro de cloreto de dopamina e 0,5 miligramas por mililitro de cloreto de paralina a 10 mililitros por quilograma por injeção intraperitoneal ao camundongo. Em seguida, coloque um disco aquecedor sob os suportes auriculares e o suporte incisivo para manter a temperatura do animal durante a cirurgia e posicione o animal na altura ideal para encaixar os suportes auriculares e incisivo no estereotáxico. Aguarde 15 minutos após a injeção da mistura de cloreto de dopamina e cloreto de paralina.

Coloque o camundongo em uma câmara fechada e selada. Anestesie o animal por inalação de isoflurano. O animal está suficientemente anestesiado quando não apresenta resposta ao aperto na pata traseira e não possui reflexo de piscar.

Em seguida, depile a parte superior da cabeça do camundongo. Neste momento, coloque o camundongo no estereotáxico. Insira a barra incisiva em sua boca e uma máscara de anestesia sobre seu rosto.

Em seguida, ajuste a taxa de fluxo do isoflurano. Aplique o analgésico tópico lidocaína diretamente sobre a pele utilizando algodão. Ajuste a barra incisiva e os cones auriculares para nivelar o topo do crânio.

Em seguida, esterilize a pele com solução de Betadine. Depois, insira as conchas auriculares. As conchas auriculares estão inseridas corretamente quando a cabeça estiver completamente plana e não puder ser movida em nenhuma direção.

Em seguida, corte ao longo da linha média da cabeça usando uma lâmina de bisturi e retrai a pele. Seque a superfície do crânio usando uma gaze. Empurre o êmbolo da seringa de um microlitro e insira a agulha de injeção de 33 graus no tubo de um mililitro contendo 15 miligramas por mililitro.

Solução de seis hidroxidopamina coberta com papel-alumínio. Puxe lentamente o êmbolo para trás, mantendo a agulha de injeção de 33 gauge imersa na solução de seis hidroxidopamina. Em seguida, avance a ponta da agulha de injeção em direção ao B bgma e libere uma pequena quantidade da solução de seis hidroxidopamina para formar uma pequena gota.

Em seguida, abaixe lentamente a ponta da agulha de injeção até o forame. Quando a esfera tocar o bgma, pare de avançar a agulha e registre essas coordenadas. Retraia a agulha de injeção dois milímetros na direção dorsal e mova-se ao longo da sutura sagital em direção rostral em direção a Lambda.

Quando estiver acima de Lambda, dispense uma pequena quantidade de solução de seis hidroxidopamina pela agulha de injeção para formar uma pequena gota. Em seguida, abaixe lentamente a ponta da agulha até Lambda. Quando a gota tocar Lambda, pare de avançar a agulha e registre essas coordenadas.

As coordenadas medial lateral e dorsal ventral devem ser idênticas para BMA e Lambda. Se não forem, ajuste a barra incisiva conforme necessário. Para as coordenadas ântero-posteriores e as barras auriculares das coordenadas medial lateral, mova a agulha até as coordenadas de injeção.

AP menos 1,2 milímetros ml menos 1,1 milímetros em relação ao rema, dispense uma pequena quantidade de solução da agulha de injeção para formar uma pequena gota. Abaixe a pequena gota sobre o crânio para marcar o local onde será feito o orifício. Em seguida, retire a agulha e faça um orifício no crânio usando uma agulha de calibre 25.

Retorne a agulha de injeção às coordenadas de injeção e insira a agulha até menos cinco milímetros na direção dorsal-ventral. Em seguida, infunda 0,2 microlitros de seis hidroxidopamina ou veículo unicamente no feixe medial do prosencéfalo a uma taxa de 0,1 microlitro por minuto. Após a conclusão da administração de seis hidroxidopamina ou veículo, mantenha a agulha no local por mais cinco minutos para permitir a difusão a partir do sítio de injeção.

Após isso, retire lentamente a agulha, feche a incisão no couro cabeludo com três pontos de sutura e, em seguida, administre um mililitro de solução de ringer lactato por via subcutânea. Por fim, remova o animal do estereotáxico e coloque-o na gaiola de recuperação até que a consciência seja recuperada. De 15 a 21 dias após a cirurgia de lesão com seis hidroxidopamina.

Quando a quantidade de morte celular provocada pelo neurotoxina atinge seu ponto máximo, podem-se medir rotações espontâneas de 360 graus para avaliar a eficácia da lesão por seis hidroxidopamina. Nessa avaliação comportamental, camundongos com esgotamento induzido por seis hidroxidopamina superior a 95% exibem significativamente mais rotações ipsiversas espontâneas do que camundongos com lesão parcial por seis hidroxidopamina ou submetidos a cirurgia simulada. Ao correlacionar os níveis de dopamina no SAL com a porcentagem de rotações espontâneas ipsiversas em cada animal, observa-se que camundongos que apresentaram 70% ou mais de rotações ipsiversas após a lesão por seis hidroxidopamina perderam mais de 95% da dopamina no SAL.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar efetivamente uma lesão estereotáxica e com perfusão controlada por seis hidroxidopamina em camundongos. Isso resultará em um nível de esgotamento da dopamina superior a 95%. Além disso, você deverá compreender como realizar a avaliação comportamental do parkinsonismo em camundongos.