Name: Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprenda a estudar os efeitos da tensão de cisalhamento na adesão bacteriana a células hospedeiras usando câmaras de fluxo e análise microscópica. Este método permite quantificar a colonização bacteriana em condições fisiológicas.

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Os autores gostariam de agradecer a Emilie Mairey e Emmanuel Donnadieu para a instalação inicial do procedimento.

1. Célula hospedeira humana e cultura bacteriana <ol><li> HUVECs cultura entre passagem 1 e 9 a 37 ° em uma incubadora umidificada com 5% (v / v) de CO 2. Passagem das células quando se aproximam de 80% confluência com tripsina / EDTA para fornecer culturas de manutenção em 75 cm 2 frascos de cultura e culturas experimentais em câmaras de fluxo descartáveis ​​(μ-Slides VI). </li><li> Retirar médio dos frascos para ser várias passagens, lavar as células com 10 ml de PBS, retirar e substituí-lo com 1,5 ml de tripsina / EDTA. Permitir que as células para separar uma cultura de células em incubadora por 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Coletar as células com 10 ml de meio de cultura de células em um tubo de coleta de 15 ml. Agregar as células com uma centrifugação de 5 minutos (a 200 g), à temperatura ambiente. Suspender as células em 4 ml de Endo-SFM suplementado com 10% (v / v) FBS e contá-los em uma câmara de Malassez, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Introduzir 30 mL de uma 1x10 6 células por ml de suspensão HUVEC no canal (3x10 4 no total) e permitir que as células a aderir durante 3 horas a 37 ° em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% (v / v) de CO 2. Adicionar um volume adicional de 120 mL de Endo-SFM para encher os poços. Células devem formar uma monocamada confluentes (Figura 2). </li><li> Crescer N. meningitidis expressando GFP (neste caso a tensão 8013 GFP expressar sob o controle de um promotor IPTG indutível), em placas de agar GCB contendo suplementos Kellogg e 5 mg / ml de cloranfenicol, a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) CO 2 durante 16 horas. </li></ol> 2. Adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras <ol><li> Ajustar a concentração de bactérias cultivadas em placas de ágar GCB a um OD600 de 0,05 com pré-aquecido Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS e incubar por 120 minutos a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) de CO 2, sob agitação suave (130 rpm). Induzir a expressão GFP adicionando 1 mM IPTG para o meio de cultura para o período de incubação todo. </li><li> Coloque o Slide-μ descartáveis ​​no palco de um microscópio invertido equipado com uma plataforma aquecida para manter a temperatura da amostra a 37 ° C. </li><li> Despeje pré-aquecido Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS em um copo de vidro esterilizado e encher uma seringa estéril 50 ml com este meio. Anexar a "entrada" tubulação para a seringa e encher com a introdução médio. </li><li> Conecte o "entrada" para o tubo μ Slide-, com cuidado, a fim de evitar a introdução de ar na câmara. Então, apor a "saída" do tubo para o outro lado e, cuidadosamente, encher o canal com média de aproximadamente 1 cm de distância da câmara "exit". </li><li> Medir o OD600 bacteriana e ajustar para 0,15 em Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS. A fim de olhar para as bactérias individual, qualquer agregados deve ser interrompido por vórtex vigoroso da amostra bacteriana. </li><li> ML colocar 100 de Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS médio para o reservatório e adicionar 100 ml da solução bacteriana tomadas a partir do topo da solução agitadas para evitar qualquer amostragem restantes agregados de bactérias. </li><li> Cuidadosamente introduzir o volume de 200 mL para o μ Slide-girando a torneira para injetar a bactéria para dentro da câmara. </li><li> Introduzir Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com uma tensão de cisalhamento compatível com adesão de 0,044 dinas / cm 2 por 15 minutos. </li></ol> Ver, por exemplo video 1 ou figura 3. Após esta etapa, mova os pontos 3, 4 ou 6. 3. Quantificação da adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras <ol><li> Após a adesão inicial de 15 minutos, adquirir imagens de dez campos aleatoriamente enquanto o líquido ainda está circulando. </li><li> Analisar as imagens obtidas utilizando o software ImageJ 8, a fim de acessar o número médio de bactérias adherant por campo. Isto é feito da seguinte forma: em primeiro lugar, cada imagem é thresholded usando o "Threshold" janela encontrados no menu "Imagem" para destacar individuais aderir bactérias fluorescentes, minimizando o fundo das células. Então, cada única bactéria é contado, usando o Plug-In "Counter Cell" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Os dados para cada imagem são relatados em uma planilha do Excel e são em média de quantificar o número médio de bactérias aderentes por campo. </li></ol> 4. Medir a resistência ao fluxo de bactérias individuais aderentes para células hospedeiras <ol><li> Bomba da seringa programa set-up para gerar tensão de cisalhamento variando 3-100 dinas / cm 2 por 5 minutos. </li><li> No final dos 5 minutos, adquirir dez campos escolhidos aleatoriamente, conforme descrito no passo 3.1, mas com o fluxo interrompido prior à aquisição. </li><li> Analisar as imagens obtidas como descrito no passo 3.2 e quantificar o número médio de bactérias remanescentes por campo. </li></ol> 5. Medir o crescimento de uma bactéria isolada aderente a um microcolony <ol><li> Introduzir Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com o stress de cisalhamento escolhido por várias horas. Gravar imagens em tempo real microscopia de vídeo em um quadro a cada 5 minutos. </li><li> Após microscopia de vídeo, parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. Um exemplo da proliferação bacteriana pode ser visto no vídeo 2. </li></ol> 6. Medir a resistência ao fluxo de aderentes microcolônias bacteriana <ol><li> Após a formação de microcolônias grandes na superfície celular (step5.2) 03/02 adquirir imagens de ambas as células (por contraste de fase) e bactérias (por GFP-fluorescência) antes da aplicação do fluxo. Para o resto do experimento, o protocolo de aquisição vai monitorar somente a fluorescência. </li><li> Aplicação de tensão de cisalhamento alta por 5 minutos (300-100 dinas / cm 2) e gravar imagens em um quadro a cada 5 segundos. </li><li> Parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. </li><li> Em seguida, remover o "exit" tubo de primeira e com cuidado, para evitar o esvaziamento do canal e em seguida, adicione pré-aquecido meio fresco para encher os poços antes de remover a "entrada" da tubulação. </li><li> Para determinar quantitativamente o efeito do estresse de cisalhamento sobre a resistência bacteriana, um ensaio de revestimento pode ser realizado da seguinte forma: recolher os restantes médio e lavar a μ Slide-duas vezes com 120 mL de PBS, que remove o meio restantes do canal (ambos lavagens são ) também coletados. </li><li> Separar as células infectadas com a adição de 50 l de tripsina / EDTA por 5 minutos a 37 ° e misturar esta amostra isolada com a suspensão coletadas na etapa anterior. </li><li> Realizar diluições em série em PBS e placa de uma fração 10 ml em placas de agar GCB, em triplicado, a fim de determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> Vídeos 3 e 4 comparam a estirpe selvagem com o mutante pilV. 7. Desapego bacteriana de microcolônias <ol><li> Infectar as células na câmara de fluxo, repetindo os passos 2.1 a 2.8 e permitem que a infecção se durante 30 minutos. </li><li> Remover as bactérias não ligado, aumentando o fluxo para 10 dinas / cm 2 por um período de 2 minutos e permitir a infecção para continuar por 2h. </li><li> Reduzir o fluxo para 0,15 dinas / cm 2. </li><li> A cada hora, recolher uma gota de médios saindo da câmara de fluxo. </li><li> Realizar diluições seriadas das amostras e da placa-los em placas de ágar GCB. </li><li> Determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> 8. Resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Diferentes etapas de uma monocamada celular que pode ser observado e medido na presença de fluxo no processo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: monocamada de células endoteliais na câmara de fluxo no início de um experimento (ausência de tensão de cisalhamento). Cerca de 50 células endoteliais são organizadas em uma monocamada sub-confluentes. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Representação gráfica de adesão inicial de bactérias na superfície celular. Valores para três campos são indicados para dar uma idéia da variação de campo para campo, que é esperado (0.044 dinas / cm 2). Vídeo 1. Visualization de adesão inicial de bactérias na monocamada celular como uma função do tempo (0044 dinas / cm 2). Expressando GFP-bactérias estão seguindo a direção do fluído. O filme é acelerado 60 vezes, a duração real do vídeo é de 10 minutos. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Video 2. Depois de bactérias adesão inicial foram autorizados a se proliferar na superfície celular por um período de 7 horas (acelerada mil vezes). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Vídeo 3. Após Proliferação na superfície celular do mecânicoal resistência de microcolônias foi testada através do aumento do nível de tensão de cisalhamento a 10 dinas / cm 2 por 5 minutos, mas microcolônias tipo selvagem são resistentes acelerou 60 vezes. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Video 4. Microcolônias formado pelo mutante pilV são interrompidos por aumentar o fluxo (10 dinas / cm 2). Este mutante não induzir a remodelação da membrana plasmática sob microcolônias e é, portanto, mais altamente sensíveis ao aumento da tensão de cisalhamento (vídeo é acelerado 60 vezes) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
<li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li>
<li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li>
<li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li>
<li>Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoyer%2C+M+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%29%22">Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)</a>. Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li>
<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A importância da tensão de cisalhamento e, em geral de aspectos mecânicos em biologia é cada vez mais reconhecido. Por exemplo, as propriedades altamente adaptados adesivo da família Selectina de proteínas no processo de adesão de linfócitos e rolando na parede vascular tem sido reconhecida através da introdução de tensão de cisalhamento no processo. O procedimento descrito acima foi aplicado aos Gram-negativos bactéria Neisseria meningitidis, mas deve ser aplicável a uma ampla gama de patógenos. A importância da tensão de cisalhamento foi mostrado também para outros patógenos e sites de outras infecções. Adesão bacteriana condicionada pela tensão de cisalhamento foi descrita pelo estudo da adesina FimH encontrado em Escherichia coli uropathogenic (UPEC) 9. Semelhante ao selectinas, a interação entre FimH e seu receptor da célula hospedeira mostrou-se reforçada por cisalhamento induzida por forças mecânicas 9 eo CFAE adesina de E. coli enterotoxigênica foi relatado também para mediar a adesão de células do epitélio intestinal através de um corte-dependente mecanismo 10. Relatamos, usando o protocolo de fluxo laminar câmara de ensaio descritos neste capítulo que o Streptococcus agalactiae pili foram essenciais para a adesão deste patógeno a células epiteliais em condições de escoamento 11. Esses estudos confirmam que o nosso ensaio de câmara de fluxo é uma ferramenta útil para a investigação de células do hospedeiro-patógeno interações sob condições de estresse de cisalhamento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> μ Slide-VI 0,4 kit fluxo </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Seringa de 50 ml Plastipak Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tubulação de Tygon R3603 3,2 x 4,8 milímetros </td><td> Fisher-Científico </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Torneira de 3 vias, 2 luer fêmea luer macho </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscópio invertido, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD ou ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

apresentando tensão de cisalhamento em o estudo da adesão bacteriana

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Durante infecções bacterianas uma seqüência de interações ocorrem entre o patógeno e seu hospedeiro. Adesão bacteriana à superfície da célula hospedeira é muitas vezes o passo inicial e determinante da patogênese. Embora experimentalmente a adesão é mais estudado em condições estáticas de adesão ocorre realmente na presença de fluxo líquido. Primeiros encontros entre as bactérias e seu hospedeiro, muitas vezes ocorrem no nível das mucosas, boca, pulmão, intestino, olhos, etc, onde o muco flui ao longo da superfície das células epiteliais. Depois da infecção, patógenos, ocasionalmente, o acesso a circulação sanguínea causando doenças graves, como sepse, septicemia e meningite. A característica definidora dessas infecções é a habilidade desses patógenos para interagir com as células endoteliais na presença de sangue circulante. A presença de fluxo de muco, líquido ou sangue, por exemplo, determina a adesão porque gera uma força mecânica sobre o patógeno. Para caracterizar o efeito do fluxo de um líquido geralmente se refere à noção de tensão de cisalhamento, que é a força tangencial exercida por unidade de área por um fluido em movimento perto de uma parede fixa, expressa em dinas / cm 2. Intensidades de tensão de cisalhamento variam muito de acordo com o tipo de embarcações diferentes, o tamanho do órgão, localização etc (0-100 dinas / cm 2). Circulação nos vasos capilares pode atingir valores de tensão de cisalhamento muito baixas e até mesmo parar temporariamente durante períodos que variam entre alguns segundos a vários minutos 1. Na outra extremidade do espectro de tensão de cisalhamento nas arteríolas pode chegar a 100 dinas / cm 2 2. O impacto da tensão de cisalhamento em diferentes processos biológicos tem sido claramente demonstrado como por exemplo, durante a interação de leucócitos com o endotélio 3. Para levar em conta esse parâmetro mecânico no processo de adesão bacteriana aproveitamos um procedimento experimental baseado na utilização de um fluxo descartáveis ​​câmara 4. Células hospedeiras são cultivadas em câmara de fluxo e bactérias fluorescentes são introduzidas no fluxo controlado por uma bomba de seringa. Inicialmente focada nossas investigações sobre o patógeno Neisseria meningitidis bacteriana, uma bactéria Gram-negativa responsável por septicemia e meningite. O procedimento descrito aqui nos permitiu estudar o impacto da tensão de cisalhamento sobre a capacidade das bactérias para: aderir às células 1, a proliferar na superfície da célula 5 e destacar a colonizar novos sites 6 (Figura 1). Informações técnicas complementares podem ser encontrados na referência 7. Valores de tensão de cisalhamento aqui apresentados foram escolhidos com base em nossa experiência anterior e 1 para representar os valores encontrados na literatura. O protocolo deve ser aplicável a uma ampla gama de patógenos, com ajustes específicos dependendo dos objetivos do estudo.

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Durante as infeções bacterianas, ocorre uma sequência de interações entre o patógeno e o seu hospedeiro. A adesão bacteriana à superfície da célula do hospedeiro é frequentemente o...

Este vídeo demonstra um procedimento para estudar os efeitos do estresse de cisalhamento na adesão bacteriana. Durante uma infecção grave por um patógeno bacteriano, como *Neisseria meningitidis*, o patógeno atinge a corrente sanguínea, onde se liga a e coloniza células hospedeiras sob estresse mecânico provocado pelo fluxo sanguíneo. Após a proliferação, algumas bactérias se destacam e colonizam novos locais, reiniciando o ciclo. Para estudar os fatores que afetam a adesão bacteriana às células hospedeiras, células endoteliais são introduzidas em câmaras de fluxo descartáveis e cultivadas até atingirem confluência.Bactérias fluorescentes são adicionadas e o estresse de cisalhamento é controlado experimentalmente. Utilizando uma bomba de seringa, a adesão das bactérias às células hospedeiras e sua proliferação são acompanhadas microscopicamente. Os vídeos resultantes são analisados para determinar o efeito do estresse de cisalhamento no processo de colonização do endotélio.Este procedimento pode ser muito útil para estudar a patogênese da meningite causada por nice, mas também pode ser utilizado para outras bactérias que são submetidas a tensão de cisalhamento durante o processo de patogênese. Essa técnica pode ser um pouco complicada de realizar, particularmente ao introduzir bolhas no sistema, o que pode ser um problema. Assim, hoje, demonstrando o procedimento, estará mega, uma estudante de doutorado que trabalha no meu laboratório.Os experimentos descritos neste vídeo são realizados utilizando células cultivadas em uma lâmina microscópica IDI seis 0,4, consistindo em uma lâmina plástica descartável e estéril contendo seis canais com 17 milímetros de comprimento, 3,8 milímetros de largura e 0,4 milímetros de profundidade. Cada canal possui duas portas de acesso com conectores luer, uma em cada extremidade, para introduzir as células UVE. Pipete 30 microlitros de uma suspensão celular de 1 × 10⁶ células em cada um dos canais da lâmina. Deixe as células aderirem por três horas a 37 °C em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% CO₂.Após a incubação, adicione mais 120 microlitros de SFM endo. Para preencher os poços, as células devem formar uma monocamada subconfluente após cerca de 20 horas. Enquanto isso, faça estrias de *Neisseria meningitidis* expressando GFP em APLs; a bactéria é um patógeno humano.Portanto, qualquer manipulação deste microrganismo deve ser realizada em uma instalação com nível de segurança dois, por pessoal treinado utilizando jaleco e luvas; recomenda-se a vacinação do pessoal contra o grupo sorológico utilizado. Aqui está a linhagem 8 0 1 3. Expressando GFP, é cultivada sob o controle de um promotor indutível por IPDG.As bactérias em BPLs de GC contendo suplementos Kellogg e cinco microgramas por mililitro de cloranfenicol em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ durante 16 horas. Uma vez estabelecidas as culturas de células de mamífero, as bactérias são adicionadas às células hospedeiras no canal. Em preparação para o ensaio de fluxo, utilizando um alça de inoculação, colete as bactérias da placa de Petri e transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio de cultura de células endoteliais suplementado e pré-aquecido.Meio Endo SFM. Ajuste a densidade óptica para uma DO 600 de 0,05 diluindo a amostra no mesmo meio até um volume final de cinco mililitros. Para induzir a expressão de GFP, adicione IPTG até uma concentração final de um milimolar e incube a cultura por 120 minutos.Em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ e agitação suave. Coloque a lâmina microscópica com células endoteliais cultivadas preparadas anteriormente sobre a platina de um microscópio invertido equipado com uma plataforma aquecida para manter a temperatura da amostra a 37 graus Celsius. Despeje o meio SFM endotelial pré-aquecido suplementado com 2% de FBS em um bastão de vidro estéril e encha a seringa de 50 mililitros puxando o êmbolo.O tubo de entrada é conectado a uma torneira de três vias. Em seguida, fixe o tubo de entrada à seringa e pressione o êmbolo para preencher o tubo com o meio. Conecte cuidadosamente a outra extremidade do tubo de entrada à microplaca utilizando os conectores em ângulo reto fornecidos.Evite introduzir ar na câmara. Coloque a seringa na bomba e, em seguida, coloque uma seringa cortada de um mililitro no orifício disponível do torneira de três vias como reservatório. Em seguida, fixe o tubo de saída na outra extremidade do canal e encha cuidadosamente o canal com meio, empurrando o êmbolo da seringa até uma distância aproximada de um centímetro da saída da câmara.Meça a DO 600 bacteriana e ajuste-a para 0,15 em SFM endo contendo 2% de FBS, como antes, agitando vigorosamente a amostra em vórtex para romper os agregados bacterianos. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur plástica descartável, transfira 100 microlitros de fm endo, suplementado com meio contendo 2% de FBS, para o reservatório. Então, aspire 100 microlitros da solução bacteriana a partir do topo da solução em vórtex e adicione ao reservatório.Gire cuidadosamente a torneira de passagem e injete as bactérias na câmara da lâmina microscópica para permitir que a adesão prossiga na presença de um nível controlado de tensão de cisalhamento. Introduza o meio SFM endo contendo 2% de FBS na câmara utilizando a bomba de seringa a 3,5 mililitros por hora durante 15 minutos. Este vídeo está acelerado 60 vezes.A duração real é de 10 minutos. Após esta etapa, a adesão e a dessacoplamento de bactérias às células hospedeiras sob diversas condições podem ser avaliados, conforme será descrito nas próximas seções do vídeo. Para quantificar a adesão inicial de bactérias individuais às células hospedeiras, comece a adquirir imagens após 15 minutos de fluxo, enquanto o líquido ainda está circulando; adquira imagens de 10 campos aleatórios para determinar o número médio de bactérias aderidas por campo observado.Inicie abrindo o software ImageJ e abra a imagem a ser analisada. Comece clicando no menu imagem e selecionando. Ajuste o brilho e o contraste.Otimize a visualização de bactérias fluorescentes individuais aderidas ao fundo ajustando os níveis de intensidade movendo o cursor. Em seguida, no plugin, analise o menu contador de células. Abra a ferramenta contador de células, inicialize a imagem, escolha o objeto, o tipo e clique em cada bactéria individualmente.O número total de bactérias aparece na janela. Por fim, exporte os dados de cada imagem para o Excel e faça a média para quantificar o número médio de bactérias aderidas por campo, a fim de medir a resistência ao fluxo das bactérias aderidas individuais. Após os 15 minutos iniciais do programa de fluxo, a bomba de seringa é configurada para gerar uma tensão de cisalhamento variando de três a 100 dimes por centímetro quadrado durante cinco minutos.Após os cinco minutos, interrompa o fluxo e adquira e analise 10 campos aleatórios como antes, para determinar o número médio de bactérias remanescentes por campo. Após os 15 minutos iniciais de fluxo, ajuste a bomba de seringa para a tensão de cisalhamento selecionada. Deixe o fluxo ocorrer por várias horas, registrando imagens a uma taxa de um quadro a cada cinco minutos.Idealmente, várias posições podem ser acompanhadas se o microscópio estiver equipado com uma plataforma motorizada XY. Após a microscopia em vídeo, interrompa o estresse de cisalhamento desligando a bomba de seringa. Adquira duas a três imagens adicionais imediatamente e, em seguida, pare a sequência de aquisição de imagens no software.Um exemplo de proliferação bacteriana pode ser visto aqui. Finalmente, para analisar as imagens, utilize o menu de ajuste de limiar do ImageJ para converter as imagens em binário. Em seguida, no menu analisar, em configuração de medição, selecione a medição de área.Em seguida, utilize a ferramenta de análise de partículas para determinar automaticamente o tamanho das colônias. Grandes microcolônias se formam na superfície celular após cinco a sete horas, com ou sem manutenção do fluxo neste momento. Para medir a resistência da microcolônia ao fluxo, primeiramente adquira duas a três imagens de ambas as células por contraste de fase e das bactérias por fluorescência GFP.Aplicar alto estresse de cisalhamento por cinco minutos e capturar imagens de fluorescência a cada cinco segundos. Interromper o estresse de cisalhamento desligando a bomba de seringa. Adquirir duas a três imagens adicionais e, em seguida, encerrar a sequência de aquisição de imagens no software antes de coletar o meio para um ensaio de plaqueamento.Primeiro, remova o tubo de saída tomando cuidado para evitar esvaziar o canal. Adicione meio fresco pré-aquecido para preencher as cavidades. Em seguida, remova o tubo de entrada e colete o meio restante com uma pipeta microliterada, transferindo-o para um tubo de microcentrífuga. Para remover qualquer meio remanescente do canal, lave a lâmina microscópica duas vezes adicionando 120 microlitros de PBS ao canal.Incline o lâmina duas vezes e descarte o meio. Para coletar as células infectadas, adicione 50 microlitros de tripsina EDTA à lâmina microscópica e incube por cinco minutos a 37 graus para destacá-las do canal e misture essa amostra destacada com uma suspensão coletada na etapa anterior. Após realizar diluições seriadas em placas de PBS, aplique frações de 10 microlitros em placas de ágar GCB e incube em triplicata a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ durante a noite.No dia seguinte, determine o número de unidades formadoras de colônias para avaliar a dessacoplamento bacteriano de microcolônias. Infete as células na câmara de fluxo como antes, com fluxo baixo de 3,5 mililitros por hora; após 30 minutos, remova as bactérias não ligadas aumentando o fluxo para cinco mililitros por minuto durante um período de dois minutos e, em seguida, retorne ao fluxo baixo de 3,5 mililitros por hora e permita que a infecção prossiga por duas horas. A cada hora, colete uma gota do meio que sai da câmara de fluxo em um tubo de microcentrífuga durante quatro horas.Após a coleta de todas as amostras, determine o número de unidades formadoras de colônias como anteriormente. Esta é uma representação gráfica da adesão inicial de bactérias à superfície celular. Cada linha no gráfico representa o número cumulativo de bactérias ligadas em um determinado campo em função do tempo.Valores de três campos são indicados para dar uma ideia da variação entre campos que é esperada após a proliferação na superfície celular. A resistência mecânica de microcolônias foi testada aumentando o nível de tensão de cisalhamento para 10 dina por centímetro quadrado, mas enquanto microcolônias do tipo selvagem são resistentes, microcolônias formadas pelo mutante pill v são desorganizadas pelo aumento do fluxo. Esse mutante é incapaz de induzir a remodelação da membrana plasmática sob microcolônias e, portanto, é mais sensível ao aumento da tensão de cisalhamento após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para que outros pesquisadores na área de doenças infecciosas explorassem o impacto do estresse cisalhante sobre a interação de diversos patógenos com diferentes tipos celulares. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos humanos pode ser extremamente perigoso e que precauções apropriadas, como medidas de nível dois ou três, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Ditkowski, B., et al. Um modelo in vitro de um sistema de perfusão de placas paralelas para estudar a adesão bacteriana a tecidos de enxerto. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o método de usar uma câmara de fluxo de placas paralelas para perfundir bactérias marcadas fluorescentemente sobre tecidos de enxerto vascular, permitindo uma análise controlada da adesão bacteriana e da patogênese precoce sob condições de fluxo de cisalhamento.

Modelo in vitro de fluxo paralelo de placas para estudar a adesão bacteriana em biópsia de tecido

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

A ligação bacteriana às células hospedeiras é uma etapa fundamental durante a colonização e infecção do hospedeiro. Este protocolo descreve a geração de adesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiais biomiméticos que permitem a análise da contribuição de adesinas individuais para esses processos, independentemente de outros fatores bacterianos.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

aderências na superfície celular são centrais na mecanotransdução, como eles transmitem tensão mecânica e iniciar as vias de sinalização envolvidos na homeostase e desenvolvimento do tecido. Aqui, apresentamos um protocolo para dissecar as vias bioquímicas que são ativadas em resposta à tensão, utilizando microesferas magnéticas revestidas com ligando e aplicação de força para receptores de adesão.

Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Aqui, descrevemos a utilização de um biorreator de maior rendimento microfluidic juntamente com um microscópio fluorescente para a análise dos efeitos da tensão de cisalhamento em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa expressando proteínas fluorescentes verdes, incluindo o instrumento configurar, a determinação de propriedades morfológicas, taxa de crescimento e cobertura do biofilme.

Ao vivo celular análise de tensão de cisalhamento na Pseudomonas aeruginosa , usando um sistema automatizado de Microfluidic superior-taxa de transferência

Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Aprenda a estudar os efeitos da tensão de cisalhamento na adesão bacteriana a células hospedeiras usando câmaras de fluxo e análise microscópica. Este método permite quantificar a colonização bacteriana em condições fisiológicas.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

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