Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Este vídeo demonstra um procedimento para estudar os efeitos do estresse absoluto na adesão bacteriana. Durante uma infecção grave por um patógeno bacteriano, como o bom sirium mens, o patógeno atinge a corrente sanguínea lá, ele se liga e coloniza as células hospedeiras enquanto sob estresse mecânico do fluxo de sangue após a proliferação, algumas bactérias se separam e colonizam novos locais e o ciclo começa novamente para estudar os fatores que afetam a adesão bacteriana às células hospedeiras. As células endoteliais são introduzidas em câmaras de fluxo descartáveis e cultura para permitir que as células atinjam a confluência.

Bactérias fluorescentes são adicionadas e o estresse absoluto é controlado experimentalmente. Usando uma bomba de seringa, a adesão da bactéria às células hospedeiras e a proliferação são seguidas microscopicamente. Os vídeos resultantes são analisados para determinar o efeito da tensão de cisalhamento no processo de colonização do endotélio.

Este procedimento pode ser muito útil para estudar a patogênese da meningite agradável, mas também pode ser usado para outras bactérias que são submetidas ao estresse de cisalhamento durante todo o processo de patogênese. Essa técnica pode ser um pouco complicada de fazer, principalmente quando se trata de introduzir bolhas no sistema, o que pode ser um problema. Então, hoje, demonstrar o procedimento será mega, um estudante de doutorado trabalhando no meu laboratório.

Os experimentos descritos neste vídeo são realizados usando células cultivadas em uma micro lâmina IDI seis 0,4 consistindo em uma lâmina de plástico estéril descartável contendo seis canais de 17 milímetros de comprimento e 3,8 milímetros de largura com 0,4 milímetros de profundidade. Cada canal tem duas portas de acesso com adaptadores de isca, uma em cada extremidade para introduzir células uve, pipetar 30 microlitros de um vezes 10 para a suspensão de seis células em cada um dos canais. No slide, deixe as células aderirem por três horas a 37 graus e uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% de CO2.

Após a incubação, adicione mais 120 microlitros de endo SFM. Para encher os poços, as células devem formar uma monocamada subconfluente após cerca de 20 horas. Enquanto isso, a GFP expressando uma boa meningite de sirium em APLs, a bactéria é um patógeno humano.

Portanto, qualquer manipulação deste microrganismo deve ser realizada em uma instalação de segurança de nível dois com pessoal treinado vestindo avental e luvas, recomenda-se a vacinação do pessoal contra o grupo sorológico utilizado. Aqui está a cepa 8 0 1 3. A expressão de GFP é cultivada sob o controle de uma linha promotora induzível por IPDG.

As bactérias em GC BPLs contendo suplementos Kellogg e cinco microgramas por mililitro de cloranfenicol em uma incubadora de 37 graus Celsius 5%CO2 por 16 horas. Uma vez que as culturas de células de mamíferos são estabelecidas, as bactérias são adicionadas às células hospedeiras no canal. Em preparação para o ensaio de fluxo, usando uma alça de inoculação, colete as bactérias da placa de Petri, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros contendo cultura de células endoteliais pré-aquecidas e suplementadas.

Endo SFM médio. Ajustar a densidade óptica a um OD 600 de 0,05, diluindo a amostra no mesmo meio até obter um volume final de cinco mililitros. Para induzir a expressão de GFP, adicionar IPTG a uma concentração final de um milimolar e incubar a cultura por 120 minutos.

Em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius 5% CO2 com agitação suave. Coloque a microlâmina com células endoteliais cultivadas preparadas anteriormente no estágio de um microscópio invertido equipado com uma plataforma aquecida para manter a temperatura da amostra em 37 graus Celsius. Despeje o endo SFM pré-aquecido suplementado com 2% de FBS em um alto-falante de vidro estéril e encha a seringa de 50 mililitros puxando o êmbolo.

A tubulação de entrada é conectada a uma torneira de parada de três vias. Em seguida, conecte o tubo de entrada à seringa e pressione o êmbolo para encher o tubo com meio. Conecte cuidadosamente a outra extremidade do tubo de entrada à micro corrediça usando os conectores de ângulo reto fornecidos.

Evite introduzir ar na câmara. Coloque a seringa na bomba e, em seguida, coloque uma seringa cortada de um mililitro na ranhura disponível na torneira de parada como reservatório. Em seguida, fixe o tubo de saída na outra extremidade do canal e encha cuidadosamente o canal com meio, empurrando o êmbolo da seringa a aproximadamente um centímetro de distância da saída da câmara.

Meça o OD bacteriano 600 e ajuste para 0,15 e endo SFM contendo 2% FBS como antes, vórtice vigorosamente a amostra para interromper os agregados bacterianos. Em seguida, usando uma pipeta de pastagem de plástico descartável, transfira 100 microlitros de endos fm, suplementado com meio 2%FBS para o reservatório. Em seguida, aspire 100 microlitros da solução bacteriana do topo da solução de vórtice e adicione-a ao reservatório.

Gire cuidadosamente a torneira, injete as bactérias na câmara da microlâmina para permitir que a adesão prossiga na presença de um nível de tensão de compartilhamento controlado. Introduza endo SFM contendo 2% de FBS na câmara usando a bomba de seringa a 3,5 mililitros por hora por 15 minutos. Este vídeo é acelerado 60 vezes.

A duração real é de 10 minutos. Após esta etapa, a adesão e o desprendimento de bactérias às células hospedeiras sob várias condições podem ser avaliados, bem como descritos nas próximas seções do vídeo. Para quantificar a adesão inicial de bactérias individuais às células hospedeiras, comece a adquirir imagens após 15 minutos de fluxo enquanto o líquido ainda está circulando, adquira imagens de 10 campos aleatórios para determinar o número médio de bactérias aderentes por campo fotografado.

Comece abrindo o software do dia da imagem e abra a imagem a ser analisada. Comece clicando no menu de imagens e selecionando. Ajuste o contraste do brilho.

Otimize a visualização de bactérias fluorescentes aderentes individuais sobre o fundo, ajustando os níveis de intensidade movendo o cursor. Em seguida, no plugin, analise o menu do contador de células. Abra a ferramenta de contador de células, inicialize a imagem, escolha o objeto, digite e clique em cada bactéria individual.

O número total de bactérias aparece na janela. Por fim, exporte os dados de cada imagem para se destacar e calcular a média para quantificar o número médio de bactérias aderentes por campo para medir a resistência de bactérias aderentes individuais ao fluxo. Após os 15 minutos iniciais do programa de fluxo, a bomba de seringa é configurada para gerar tensão de cisalhamento variando de três a 100 centavos por centímetro quadrado por cinco minutos.

Ao final dos cinco minutos, pare o fluxo e adquira e analise 10 campos aleatórios como antes para determinar o número médio de bactérias restantes por campo. Após os 15 minutos iniciais de fluxo, ajuste a bomba da seringa para a tensão de cisalhamento selecionada. Deixe-o fluir por várias horas, gravando imagens a uma taxa de um quadro a cada cinco minutos.

Idealmente, várias posições podem ser seguidas se o microscópio estiver equipado com uma plataforma XY motorizada. Após a microscopia de vídeo, pare o estresse absoluto desligando a bomba da seringa. Adquira duas a três imagens adicionais imediatamente e, em seguida, interrompa a sequência de aquisição de imagens no software.

Um exemplo de proliferação bacteriana pode ser visto aqui. Finalmente, para analisar imagens, use o menu de limite de ajuste de imagem da imagem J para converter as imagens em binárias. Em seguida, no menu de análise em definir medição, selecione a medida da área.

Em seguida, use a ferramenta de análise de partículas para determinar automaticamente o tamanho das colônias. Grandes microcolônias se formam na superfície celular após cinco a sete horas, independentemente de o fluxo ser mantido ou não neste ponto. Para medir a resistência da microcolônia ao fluxo primeiro, adquira duas a três imagens de ambas as células por contraste de fase e bactérias por fluorescência GFP.

Aplique alta tensão de cisalhamento por cinco minutos e tire imagens de fluorescência em um quadro a cada cinco segundos. Pare a tensão de cisalhamento desligando a bomba da seringa. Adquira duas a três imagens adicionais e, em seguida, pare a sequência de aquisição de imagem no software ao lado para coletar o meio para um ensaio de revestimento.

Primeiro, remova a tubulação de saída tomando cuidado para evitar esvaziar o canal. Adicione meio fresco pré-aquecido para encher os poços. Em seguida, remova o tubo de entrada e colete o meio restante com uma micropipeta e transfira para um tubo de microcentrífuga Para remover qualquer meio restante do canal, enxágue a microlâmina duas vezes adicionando 120 microlitros ao PBS ao canal.

Inclinar a lâmina duas vezes e descartar o meio. Para coletar as células infectadas, adicione 50 microlitros de tripsina EDTA à microlâmina e incube por cinco minutos a 37 graus para separá-las do canal e misture esta amostra destacada com uma suspensão coletada na etapa anterior. Depois de realizar a diluição em série em PBS, coloque frações de 10 microlitros em placas agrícolas GCB e triplicado incubado a 37 graus Celsius 5% CO2 durante a noite.

No dia seguinte, determine o número de unidades formadoras de colônias para avaliar o desprendimento bacteriano das microcolônias. Infecte as células na câmara de fluxo como antes em baixo fluxo de 3,5 mililitros por hora após 30 minutos, remova as bactérias não ligadas aumentando o fluxo para cinco mililitros por minuto por um período de dois minutos e, em seguida, retorne ao baixo fluxo de 3,5 mililitros por hora e permita que a infecção continue por duas horas. Em seguida, a cada hora, colete uma gota de meio que sai da câmara de fluxo em um tubo de microcentrífuga por quatro horas.

Uma vez que todas as amostras tenham sido coletadas, determine o número de unidades formadoras de colônias como antes. Esta é uma representação gráfica da adesão inicial de bactérias na superfície celular. Cada linha no gráfico representa o número cumulativo de bactérias ligadas em um determinado campo em função do tempo.

Os valores para três campos são indicados para dar uma ideia da variação de campo para campo que é esperada após a proliferação na superfície celular. A resistência mecânica das microcolônias foi testada aumentando o nível de tensão de cisalhamento para 10 dines por centímetro quadrado, mas enquanto as microcolônias do tipo são resistentes, as microcolônias formadas pelo mutante pílula v são interrompidas pelo aumento do fluxo. Este mutante não consegue induzir a remodelação da membrana plasmática sob microcolônias e, portanto, é mais altamente sensível ao aumento da tensão de cisalhamento após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para outros pesquisadores no campo de doenças infecciosas explorarem o impacto do estresse de cisalhamento na interação de vários patógenos com diferentes tipos de células. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos humanos pode ser extremamente perigoso e, por precauções, como nível dois ou três, medidas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.