In vivo dupla Substrato Bioluminescent imagem
11 de outubro de 2011
Aqui, descrevemos os métodos para construir, visualizar e quantificar as reações bioluminescentes de ambos vagalume e Renilla enzimas luciferase expressos em células de câncer de mama metastático durante o seu crescimento e metástase In vivo.
Este procedimento visualiza e quantifica a ran e a luciferase de vaga-lume. No desenvolvimento de tumores ortotópicos in vivo, inicie pela construção de linhagens celulares estáveis, expressando ran vanilla ou luciferase de vaga-lume, ou ambas. Em seguida, verifique funcionalmente a regulação in vitro da construção repórter estavelmente expressa.
O próximo passo é enxertar células no coxim adiposo mamário e obter e quantificar as leituras de luciferase ran e luciferase de vaga-lume. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como imunohistoquímica, é que ela permite uma visão longitudinal e dinâmica da regulação gênica in vivo durante a progressão e metástase tumoral. Comece transfectando quatro células de carcinoma T uma memória com um vetor de expressão codificando cultura de luciferase de baunilha.
Transfete sob uma concentração otimizada de antibiótico por vários dias. Em seguida, selecione cerca de 10 colônias individuais expressando luciferase ran vanilla para monitorar o grau de expressão. Continue amplificando as colônias que expressam grandes quantidades de luciferase ran vanilla para análises funcionais.
Subclone a região promotora de interesse em um plasmídeo repórter de luciferase PGL quatro que contenha um marcador selecionável distinto daquele usado para seleção de expressão estável de vanilla, transfecte as células malignas e selecione uma população policlonal estável de luciferase de vaga-lume utilizando ensaios tradicionais de gene repórter de luciferase baseados em células in vitro em placas de 96 poços. Verifique se as células DBR regulam a expressão da luciferase de vaga-lume de maneira concordante com a observada em células parentais transfectadas de forma transitória. Com esses vetores, coloque as células em um agitador orbital por 15 minutos para lisar as células.
Também verifique se a expressão regulada pelo CMV de vanilla não é afetada por diversas estimulações celulares ou condições de tratamento. Propague as células de carcinoma de memória metastático DBR quatro um com baixa confluência no dia anterior ao planejado. Para a passagem de inoculação in vivo, dissocie as células quatro um com tripsina para inoculação.
Lave minuciosamente em meio de crescimento e dilua as células em PBS imediatamente. Armazene em gelo. Anestesie camundongos fêmeas bowel C com idades entre quatro e seis semanas com isoflurano.
Usando uma pinça, segure e levante suavemente o quarto coxim adiposo inguinal. Coloque cuidadosamente uma agulha de calibre 27,5 com o bisel voltado para cima e injete diretamente no coxim adiposo sob o mamilo.
Tendo o cuidado especial de não inserir a agulha na cavidade abdominal. Solte a glândula e injete lentamente 50 microlitros da suspensão celular no coxim de gordura mamária enquanto os camundongos ainda estiverem anestesiados. Injete 100 microlitros de cine vermelho na veia lateral da cauda.
Coloque imediatamente o camundongo no sistema de imagem IVUS 200 e adquira uma imagem luminosa de um minuto. Retorne o camundongo para sua gaiola por cerca de uma hora, o que garante que qualquer sinal residual de ranilla Lucifer tenha se dissipado. Agora, administre o sal de potássio de D Lucifer por injeção intraperitoneal após cinco minutos e anestesie o camundongo usando isofluorano.
Transfira para o IVUS 200 em uma posição comparável à da aquisição de imagem original em RAN com configuração padrão. Utilizando o software de imagem viva IVUS no modo fótons, estabeleça os valores para as aquisições firefly e para ambas as aquisições.
As células altamente agressivas 41 formam tumores palpáveis dentro de uma semana. Portanto, injete nos camundongos a cada semana vermelho eject cine para monitorar o crescimento geral do tumor e metástase. Em seguida, injete d Luciferina para monitorar a sinalização específica da via durante vários estágios do desenvolvimento tumoral.
Acompanhe o crescimento do tumor primário normalizando as aquisições de luciferase de RAN às primeiras medições realizadas na inoculação das células tumorais. Mais importante, calcule os valores de RLR ao longo do tempo para estabelecer a regulação temporal dos sistemas de sinalização individuais em relação ao crescimento e progressão do tumor. Agora, compare os valores de RLR pulmonares com aqueles calculados para o tumor primário, a fim de estabelecer a regulação espacial dos sistemas de sinalização individuais em relação ao crescimento tumoral e metástase.
Imagens bioluminescentes duplas são usadas para visualizar e acompanhar alterações na composição celular dentro do tumor primário. Primeiro, misture células T quatro expressando luciferase de baunilha com suas contrapartes T quatro sete não metastáticas e isogênicas que expressam luciferase de vaga-lume, depois injete diferentes proporções dessas populações mistas de células cancerígenas de mama na prega de gordura mamária, conforme mostrado anteriormente. Adquira imediatamente ambas as imagens de luciferase de vaga-lume e de baunilha para estabelecer a razão inicial RS representativa de uma determinada mistura de células inoculadas.
Continue obtendo imagens longitudinais duais de bioluminescência para representar a composição celular dentro do tumor primário. Avalie também a metástase espaço-temporal de cada derivado do câncer de mama em relação ao crescimento e progressão do tumor. Como cada imagem é internamente consistente e controlada, o sinal persistente proveniente do tumor primário é uma métrica importante para avaliar a falha geral de aquisição de dados sucessores para cada conjunto de dados de baunilha e luciferina.
O substrato de linina é altamente sensível à oxidação, resultando em auto-luminescência. Aqui, uma injeção intravenosa malsucedida de lanina produz sinal não específico proveniente do trato intestinal, e não do tumor primário estabelecido. Nesta aquisição renal bem-sucedida de um camundongo portador de tumor primário 41 e metástases pulmonares, medições específicas de sinalização da via podem ser derivadas da imagem da luciferase de vaga-lume.
Esses dados permitem o cálculo da RS tanto do tumor primário quanto de suas metástases pulmonares. Após a conclusão deste experimento, outras técnicas, como imunohistoquímica e hibridização in situ, podem ser utilizadas para verificar se o resultado em mRNA e proteína é regulado de maneira semelhante à do seu construto relatado.
Visão Geral
Este estudo descreve um método para construir, visualizar e quantificar reações bioluminescentes de enzimas luciferase de vaga-lume e renilla em células de câncer de mama metastático. A abordagem permite uma visão dinâmica da regulação gênica durante o crescimento tumoral e metástase in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Imagem de Bioluminescência
Contexto
- A imagem bioluminescente fornece informações sobre a progressão tumoral.
- As enzimas luciferase atuam como repórteres eficazes para a expressão gênica.
- Estudos in vivo permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica tumoral.
- Métodos existentes, como a imuno-histoquímica, carecem de capacidades longitudinais.
Objetivo do Estudo
- Visualizar e quantificar a atividade da luciferase em modelos de câncer de mama.
- Acompanhar o crescimento tumoral e a metástase ao longo do tempo.
- Comparar vias de sinalização em tumores primários e metástases.
Métodos Utilizados
- Construção de linhagens celulares estáveis que expressam enzimas luciferase.
- Enxertia de células no coxim adiposo mamário de camundongos.
- Uso de imagem bioluminescente para monitorar o crescimento tumoral.
- Quantificação de sinais luciferase para avaliar a regulação gênica.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da dinâmica de crescimento tumoral por meio de imagem com dupla luciferase.
- Estabelecimento de um método para rastrear a regulação espacial de vias de sinalização.
- Demonstração das vantagens da imagem bioluminescente em comparação com métodos tradicionais.
- Identificação de alterações temporais na expressão da luciferase durante a progressão tumoral.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia tumoral.
- A imagem bioluminescente aprimora a compreensão dos processos metastáticos.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para avaliações terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem bioluminescente de substrato duplo permite o monitoramento em tempo real e longitudinal do crescimento tumoral e da dinâmica das vias de sinalização in vivo, preenchendo uma lacuna crítica na pesquisa do câncer de mama metastático. Ao quantificar simultaneamente a carga tumoral e a expressão gênica específica da via, esta abordagem apoia a desmistificação mecanicista e a confiança preditiva na validação de alvos. Ela fornece uma plataforma escalável e reprodutível para avaliar intervenções terapêuticas nas fases de descoberta e pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da visualização da regulação espaço-temporal de sistemas de sinalização durante a evolução tumoral e metástase.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal da atividade de vias em tumores primários e metástases dentro da mesma coorte de animais.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo ao correlacionar a atividade do promotor do elemento de ligação ao Smad com a progressão metastática em lesões pulmonares.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas e internamente controladas de luminiscência para as vias da luciferase de vaga-lume e renila.
- Valor Operacional: Estabelece protocolos padronizados de imagem para aquisição e normalização de sinais de duplo substrato.
- Escalabilidade: Facilita a avaliação longitudinal do crescimento tumoral e metástase mediante imagens bioluminescentes seriadas ao longo de semanas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a dinâmica de sinalização in vivo ao crescimento metastático por meio da comparação dos valores pulmonares de RLR com as linhas de base do tumor primário.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Monitora a sinalização específica de vias durante estágios distintos do desenvolvimento e disseminação tumoral.
- Sistema Relevante para a Doença: Utiliza o modelo ortotópico de câncer de mama 4T1 para estudar alterações na expressão gênica relevantes para metástase.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao permitir a verificação de hipóteses na validação inicial de alvos, apoiar a preparação de ensaios na triagem e orientar decisões de avanço pré-clínico por meio de análise quantitativa de vias metabólicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a desmistificação biológica mediante a visualização da atividade do promotor do elemento de ligação ao Smad em contextos de tumor e metástase.
- Triagem: Fornece saídas bioluminescentes prontas para ensaios e reprodutíveis para rastrear a regulação gênica durante a progressão tumoral.
- Análises: Oferece medições quantitativas de fótons e normalização por RLR para comparar a dinâmica de sinalização em diferentes sítios tumorais e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona os sinais de luciferase com a carga metastática e o desenvolvimento de lesões pulmonares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudos longitudinais de crescimento tumoral e modulação de vias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao correlacionar o crescimento tumoral com alterações específicas nas vias de sinalização ao longo do tempo.
- Valor Operacional: Garante padronização por meio de controles internos de sinal e consistência na imagem longitudinal.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer informações dinâmicas e quantitativas sobre o engajamento do alvo e o potencial metastático.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base na regulação temporal e espacial das vias oncogênicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, geração de linhagens celulares estáveis e validação de repórteres de luciferase.
- Depende de sistemas de imagem bioluminescente capazes de detecção de fótons com substratos duplos e administração sequencial de substratos.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de imagem, dosagem de substratos e procedimentos de normalização de sinal.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes construtos repórteres de promotor e modelos de câncer além do câncer de mama 4T1.
- Inclui limitações práticas, como a sensibilidade do substrato à oxidação e possível interferência no sinal decorrente de técnicas inadequadas de injeção.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Stable Expression of CMV-Driven Renilla Luciferase
1:36
Expression, Selection, and Functional Verification of Inducible Promoter-Driven Firefly Luciferase
2:32
Establishing 4T1 Primary Mammary Tumors
3:25
Initial Dual Luminescent Imaging
4:22
Longitudinal Luminescent Imaging
5:17
Dual Bioluminescent Imaging of Two Unique Cell Types in a Single Animal
6:16
In vivo RLRs from Dual Bioluminescent Imaging
7:10
Conclusion
