Um método de genotipagem baseados em PCR para distinguir entre variedades do tipo selvagem e Ornamental de Imperata cylindrica

O principal objetivo deste procedimento é fornecer um protocolo de genotipagem molecular rápido e econômico que possa diferenciar entre variedades de Retta cylindrica, normalmente chamadas de capim-gon, que não podem ser distinguidas apenas pela morfologia. Isso é feito primeiro identificando e isolando o tecido de uma variedade de grama de interesse. O próximo passo é extrair DNA nuclear e rebocado do tecido coletado.

Em seguida, a reação em cadeia da polimerase é realizada no DNA extraído usando primers específicos da variedade que visam diferenças de sequência na região LF dos PLAs, bem como controles positivos e negativos apropriados. A etapa final é realizar eletroforese em gel em cada uma das quatro reações de PCR para visualizar os produtos de PCR amplificados. Em última análise, a variedade de capim-gon coletada é determinada por meio da análise das proibições de produtos de PCR específicos da variedade resultante no gel Os planos invasivos custam aos Estados Unidos cerca de 3,4 bilhões anualmente, causando danos substanciais aos recursos agrícolas e naturais.

O tipo selvagem imparato Electrica, também conhecido como Cogan, a grama é uma das 10 piores ervas daninhas invasoras do mundo. A grama Cogan se espalha rapidamente em povoamentos mono que deslocam a vegetação nativa e, por sua vez, os animais que dependem dessa grama GaN da vegetação nativa infestam atualmente 490 milhões de hectares em todo o mundo e cerca de 500.000 hectares nos Estados Unidos e a variedade ornamental de ti de tus centrica é amplamente comercializada sob os nomes de tus Centrica, Arbra, Baren vermelho e sangue japonês grosseiro, como chamaremos de JBG. Esta variedade é supostamente estéril e não invasiva, e é considerada desejável por suas folhas de cor vermelha.

Sob certas condições, a grama sanguínea japonesa pode produzir sementes viáveis e reverter para uma forma totalmente verde que é indistinguível da grama cogan do tipo selvagem. Como você pode ver, ambos possuem folhas verdes e são maiores do que a variedade ornamental tradicional com folhas maiores. Além disso, as plantas revertidas e selvagens apresentam rizomas maiores e a variedade ornamental aumenta seu potencial reprodutivo assexuado.

A reversão faz a identificação apenas pela morfologia. Uma tarefa difícil. Os métodos moleculares fornecem um meio de distinguir com precisão plantas invasoras e materiais vegetais que não podem ser identificados por meios visuais normais.

Os métodos moleculares são essenciais para proteger contra a disseminação e introdução de plantas invasoras. A aplicação deste protocolo molecular fornece um meio de distinguir com precisão as reversões de grama de sangue japonesa da grama Kogan. Este protocolo pode ajudar a prevenir a co-ocorrência com o capim-Kogan e a possível formação de híbridos viáveis.

A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado ou análise de FLP e coisas como sequenciamento de DNA, é que ela fornece uma técnica de genotipagem molecular rápida e muito econômica que pode distinguir facilmente a diferença entre capim kogan de tipo selvagem e variedades de capim de sangue japonês. Demonstrando a técnica estará Joseph Hery, um graduado do nosso laboratório. Primeiro, identifique um espécime de um local onde o capim-gon ou o capim-sangue japonês estão crescendo e precisam ser distinguidos um do outro.

A grama de sangue japonesa é facilmente distinguida da grama gon do tipo selvagem por suas folhas vermelhas brilhantes. No entanto, a reversão da grama de sangue japonesa é quase indistinguível da grama Kogan, pois ambas têm folhas verdes mais longas, mais área foliar e rizomas maiores do que a grama de sangue japonesa ornamental. Este método pode ser usado em tecidos de folhas frescas, congeladas e recentemente secas.

Se armazenar tecidos para extração de DNA em uma data posterior, o melhor método é congelar e armazenar o tecido a 80 graus Celsius negativos imediatamente. Se for necessário armazenamento a seco, coloque o tecido em um envelope de papel e armazene-o em sílica gel desidratada ou outros dessecantes ativos em temperatura ambiente. Se for usado tecido fresco, certifique-se de que o DNA seja extraído dentro de três horas após a coleta para evitar a degradação.

Este procedimento utiliza o mini kit de plantas DNEZ da Kyogen de acordo com as instruções do fabricante com uma pequena modificação. Aqui. O procedimento foi adaptado para que sejam utilizados mais de 100 miligramas de tecido fresco ou congelado ou mais de 20 miligramas de tecido seco. Primeiro moer mais de 100 miligramas de tecido foliar fresco ou congelado, ou mais de 20 miligramas de tecido foliar seco até formar um pó fino usando três rodadas de nitrogênio líquido com moagem em um almofariz e pilão resfriados.

Pesar o pó congelado de tecido fresco ou congelado em alíquotas de 100 miligramas. Se estiver usando tecido foliar seco, pesar o pó em alíquotas de 20 miligramas. Após esta etapa, prossiga com a extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante usando um espectrofotômetro como o teste do espectrofotômetro NanoDrop, DNA, qualidade e quantidade bons rendimentos de DNA devem estar entre 50 e 150 nanogramas por microlitro com duas proporções de 60 sobre dois 80 e 2 32 80 próximas a 2,0 como visto. Aqui.

Realize eletroforese usando um gel padrão 1% AROS. Verifique a presença de bandas relativamente grandes maiores que 10 KB com nenhum ou pouco estrias de contaminação por RNA se a concentração de DNA for alta, dilua as amostras para 70 nanogramas por microlitro para as etapas subsequentes. Os primers de PCR usados neste protocolo indicados pelas setas vermelha e verde são baseados em diferenças de sequência entre a região espaçadora LF de volta rebocada de capim Cogan e genótipos de capim sangue japonês.

Essas diferenças vêm na forma de polimorfismos de nucleotídeo único e inserções e deleções indicadas pelas setas pretas verticais, que permitem o desenvolvimento de primers específicos da variedade. Ao localizar os primers nos locais de sequências únicas, as sequências de primers estão contidas na parte escrita do protocolo para cada amostra de DNA isolada configurada duas reações de PCR de 50 microlitros em tubos de PCR de paredes finas de 0,2 mililitro no ICE usando cada conjunto de primers de acordo com o protocolo escrito. Se a concentração de DNA for baixa, mais DNA pode ser adicionado a cada reação enquanto ajusta a quantidade de água duplamente destilada livre de nuclease para que o volume total da reação permaneça em 50 microlitros.

Não use mais de cinco microlitros de DNA ou 10% do volume total por reação, pois as impurezas contidas nas amostras de DNA podem inibir as reações de PCR para garantir que todos os reagentes de PCR estejam funcionando, configurando bem o controle positivo. Usando os primers de controle positivo, configure o controle negativo usando o mesmo conjunto de primers de controle que o controle positivo, mas com água destilada dupla em vez do DNA extraído neste ponto, há um total de quatro reações de PCR para cada amostra que está sendo testada. Em seguida, realize amplificações de PCR em um termociclador equipado com uma tampa aquecida usando os parâmetros de ciclagem de PCR no protocolo escrito, a otimização para temperatura de ajoelhamento principal, tempos de extensão e número de ciclos pode ser necessária, dependendo da qualidade dos primers de DNA aderem polimerase ou do tipo de termociclador usado.

Quando as reações de PCR estiverem concluídas, separe os produtos de PCR em um gel de 1% usando eletroforese padrão. Execute as amostras em torno de 120 volts até que a frente D atinja três quartos do comprimento total do gel. Visualize o gel sob luz ultravioleta e inspecione as bandas resultantes para ver se um fragmento de DNA apropriado foi amplificado.

Este gel representativo mostra os resultados da eletroforese de produtos de PCR derivados de capim Kogan, capim sangue japonês e capim sangue japonês revertem amostras de DNA combinadas com capim Kogan e primers específicos JBG, bem como o controle positivo de LF e um controle negativo sem modelo. O conjunto de primers de controle positivo LF funciona igualmente bem para grama Cogan, grama de sangue japonesa, reversão de grama de sangue japonesa e outras gramíneas, e resultará em uma banda de 890 pares de bases. Se todos os reagentes de PCR estiverem livres de contaminantes de DNA, a reação de controle negativo não resultará em um produto de PCR.

Se a amostra de DNA for derivada de grama kogan do tipo selvagem, uma reação de PCR usando o conjunto de primers específicos da grama Kogan resultará em uma única banda em cerca de 595 pares de bases, enquanto os primers específicos do JBG resultarão em nenhuma banda. Da mesma forma, se a amostra de DNA for derivada de JBG ou reação J-B-G-A-P-C-R revertida, o uso do conjunto de primers específicos JBG resultará em uma única banda em cerca de 594 pares de bases. Enquanto os primers específicos da grama Kogan resultarão em nenhuma banda.

Como JBG e JBG revertido têm sequência de ácido nucleico idêntica, eles terão, portanto, padrões de bandas idênticos. No entanto, as diferenças morfológicas entre as reversões JBG e JBG são bastante óbvias, portanto, embora os resultados da PCR sejam os mesmos, as variedades JBG são fáceis de distinguir no nível da planta. O sequenciamento de DNA dos produtos de PCR pode identificar possíveis alterações nas sequências de DNA para diferentes ecótipos de capim-cogan.

O desenvolvimento desta técnica fornece o primeiro método molecular simplificado que pode distinguir com precisão entre o tipo selvagem K e a grama e a forma revertida de sua variedade ornamental de grama sanguínea japonesa. Incentivamos os usuários deste protocolo a entrar em contato conosco para relatar os resultados derivados do uso deste protocolo. Essas informações compartilhadas ajudarão a fornecer informações sobre a distribuição do capim de sangue japonês.

Isso também ajudará os reguladores do USDA a tomar decisões informadas sobre ações que podem ser necessárias para contornar a disseminação e a potencial hibridização das variedades de grama Cogan altamente invasivas.