RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus
16 de outubro de 2011
Em organismos modelo, transgenia pode manipular as funções dos genes, enquanto RNAi pode knockdown transcrições de mRNA específicas 1-2. Este protocolo visa ilustrar as técnicas necessárias para introduzir DNA transmitidas de maneira estável e transitórios RNA de filamento duplo para o nematóide necromenic Pristionchus pacificus Para estudos em biologia evolutiva, de desenvolvimento e comportamentais.
O objetivo geral deste procedimento é transformar com sucesso DNA estranho e reduzir a função gênica em nematoides Priyanka pacificus. Para transgênese, comece preparando o DNA genômico apropriado com extremidades coesivas compatíveis.
Para interferência de RNA, sintetize o gene de interesse utilizando um kit de transcrição de RNA de fita dupla. Em seguida, injete microscópicamente os PRIs de DIANCA pacificus com o DNA ou RNA de fita dupla. Analise a população F1 quanto ao fenótipo do marcador selecionado na transgênese e selecione os indivíduos com fenótipo de silenciamento para interferência de RNA na transgênese.
Continue monitorando os resultados de F dois vermes transgênicos para obter resultados que mostrem expressões gênicas específicas utilizando o repórter GFP por meio de microscopia de fluorescência. Olá, sou Ray Hong, da Universidade Estadual da Califórnia em Northridge, e esta demonstração descreverá as etapas para manipulação genética em nematoides específicos do gênero Pristi. Em organismos modelo emergentes, a realização de RNAi e truss Genesis pode responder perguntas fundamentais em biologia do desenvolvimento e comportamento, caracterizando funções e expressões gênicas.
Indivíduos novos neste método se beneficiarão ao observar como posicionar o verme na almofada de injeção e como injetar o verme no plano focal correto, onde os go nats são visíveis. Diferentemente dos gans, os goads específicos para SCA se cruzam dorsalmente e migram eventualmente conforme o nematodo se desenvolve do estágio final J4 até os adultos. Além disso, o DNA genômico digerido com enzimas de restrição compatíveis deve ser adicionado aos seus transgênicos e marcador de coinjeção para preparar a sua mistura de injeção.
Jessica Single poin lab no meu laboratório demonstrará a microinjeção no caso específico de PRIs para transgênese. Construtos de DNA 3D são necessários para a injeção do marcador dominante de co-injeção. Os transgenes repórter alvo e os construtos de DNA genômico são digeridos com enzimas de restrição compatíveis. Os construtos de DNA são coletados utilizando um protocolo de precipitação com etanol.
A mistura de injeção é preparada nas concentrações listadas na tabela. Verifique as configurações do manômetro do tanque de nitrogênio. Agora, carregue um a dois microlitros da mistura de injeção na agulha.
Coloque a agulha no manipulador de microinjeção. Quebre a ponta da agulha tocando-a levemente na borda de um capilar finamente puxado colocado sobre uma lâmina e posicione-a em repouso. Agora, despeje óleo de parafina para cobrir a placa de J com quatro vermes adultos jovens.
Escolha um único verme e transfira-o para uma placa de injeção. Sob o microscópio, posicione o ovário do verme na direção da agulha, com a vulva voltada para longe da agulha. Agora, abaixe a agulha até a posição do campo microscópico.
Traga o gônada superior e a agulha para o mesmo plano focal. Puxe suavemente o verme e injete a mistura. Observe os ovos se separando em direção à ponta distal, indicando uma injeção bem-sucedida.
Reposicione a agulha para injetar a gônada inferior e repita a injeção. Como esta gônada está sob o intestino, a dispersão dos ovos não será visível e, portanto, é mais difícil avaliar o sucesso da injeção. No entanto, após a injeção, o verme deve permanecer intacto, sem aguilhões protrusos.
Coloque a agulha de volta na posição ociosa. Adicione uma gota de tampão M nove para resgatar o verme usando algumas bactérias OP 50 em um palito. Toque o verme com as OP 50 de modo que ele adira.
Agora, transfira o verme para uma placa com gotas de 50 microlitros de OP50. Incube os vermes injetados a 20 graus Celsius por cerca de quatro dias para que depositem ovos e os F1 cresçam. Em seguida, analise os vermes quanto ao fenótipo selecionado.
Selecione indivíduos F1 com o fenótipo observado e transfira-os para uma nova placa com sementeira, armazenando-a a 25 graus Celsius. Por fim, para linhagens transgênicas, transfira indivíduos F2 individuais para placas separadas. Armazene as gerações subsequentes a 20 graus Celsius.
A manipulação da função gênica no nível do organismo por RNAi e transgênese são aspectos fundamentais do modelo Ppac pacificus para biologia evolutiva do desenvolvimento; comparado a um verme do tipo selvagem à esquerda, a linhagem transgênica estável F4 PPR L3 resulta em um fenótipo rolador dominante que mostra expressão de GFP em neurônios da cabeça. Por outro lado, este experimento de RNAi gera mutantes PRL1 que exibem abolição completa da locomoção rolante normalmente observada no mutante de ganho de função rolador PRL1 TU92. Uma vez dominado, cada injeção pode ser concluída em cinco minutos. É importante lembrar que todos os F2 provenientes de linhagens transgênicas F1 independentes precisam ser isolados individualmente para estabelecer promis F2 independentes.
Isso ocorre porque observamos que a expressão de GFP é altamente variável entre linhagens F2, e a transmissão do fenótipo rolador não se correlaciona com o nível de expressão de G.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra as técnicas para introduzir DNA transmitido de forma estável e RNA de fita dupla transitório no nematódeo necromênico Pristionchus pacificus. Esses métodos são essenciais para manipular funções gênicas e estudar diversos processos biológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- A transgênese permite a manipulação de funções gênicas em organismos modelo.
- A interferência por RNA (RNAi) é usada para reduzir transcritos específicos de mRNA.
- Pristionchus pacificus serve como modelo para estudos evolutivos e comportamentais.
- Compreender a função gênica é essencial para obter insights sobre processos de desenvolvimento.
Objetivo do Estudo
- Transformar com sucesso DNA estranho em Pristionchus pacificus.
- Interferir na função gênica utilizando técnicas de interferência por RNA.
- Facilitar estudos em biologia evolutiva, desenvolvimental e comportamental.
Métodos Utilizados
- Preparação de DNA genômico com extremidades coesivas compatíveis para transgênese.
- Síntese de RNA de fita dupla para interferência de RNA.
- Microinjeção de DNA ou RNA de fita dupla nos gônadas de Pristionchus pacificus.
- Tamização da população F1 para fenótipos marcadores selecionados.
Resultados Principais
- Transformação bem-sucedida de DNA estranho em nematoides.
- Redução eficaz da função gênica utilizando RNAi.
- Identificação de alterações fenotípicas na geração F1.
- Demonstração da utilidade de Pristionchus pacificus em estudos genéticos.
Conclusões
- As técnicas descritas são eficazes para manipulação genética em nematódeos.
- Esses métodos podem avançar a pesquisa em diversas áreas biológicas.
- Pristionchus pacificus é um organismo modelo valioso para o estudo da função gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de manipulação genética confiável em organismos modelo emergentes, como o Pristionchus pacificus, amplia as capacidades de validação de alvos para além dos sistemas tradicionais. Este método permite a redução mecanicista de riscos em vias evolutivamente conservadas por meio de silenciamento gênico direto e transgênese estável. Ele contribui para o desenvolvimento de modelos pré-clínicos ao fornecer um sistema geneticamente acessível para triagem fenotípica e descoberta de biomarcadores em ensaios baseados em nematoides.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da diminuição mediada por RNAi de alelos mutantes dominantes, como prl-1(tu92), para avaliar a função gênica em fenótipos de locomoção.
- Valor Operacional: Fornece um protocolo reprodutível de microinjeção para gerar linhagens transgênicas estáveis que expressam repórteres GFP sob promotores tecido-específicos.
- Valor Preditivo: Facilita a elucidação de vias biológicas ao permitir a observação direta dos efeitos da redução gênica em fenótipos neurais e musculares na prole F1.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Produz populações F1 sincronizadas adequadas para triagem de alto conteúdo de fenótipos de silenciamento gênico, utilizando marcadores visíveis como locomoção rolante.
- Saída quantitativa: Permite a quantificação baseada em fluorescência da expressão de transgenes (por exemplo, GFP) em gerações F2 para análise de resposta à dose e penetrância.
- Reutilização da plataforma: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado de microinjeção aplicável a múltiplos transgenes e construtos de RNAi em P. pacificus.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Apoia estudos de conservação evolutiva de vias neurogênicas e metabólicas relevantes para modelos de doenças humanas.
- Continuidade Translacional: Permite a progressão do silenciamento gênico em F1 até o estabelecimento de linhagem estável em F2 para avaliação fenotípica longitudinal.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz falsos positivos na validação de alvos ao confirmar a ligação entre fenótipo e genótipo por meio de análise de resgate e segregação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a avaliação da função gênica antes da identificação do composto líder, com os resultados orientando a seleção do alvo e acompanhamentos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio de silenciamento gênico reversível e superexpressão estável para esclarecer as relações entre genes e fenótipos.
- Triagem: Gera linhagens transgênicas prontas para ensaios com repórteres detectáveis para estudos de sensibilidade a compostos e interações genéticas.
- Análises: Fornece saídas quantitativas de fluorescência e pontuação fenotípica para comparar condições genéticas e avaliar penetrância.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação gênica a resultados fenotípicos em um sistema com vias de desenvolvimento conservadas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de microinjeção transferível para validação iterativa de alvos em múltiplos genes e linhagens.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao permitir perturbação genética direta em um modelo de nematódeo geneticamente tratável.
- Valor Operacional: Oferece protocolos padronizados e reprodutíveis para transgênese e RNAi, com parâmetros definidos de injeção e cronogramas de triagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção com base na redução da ambiguidade mecanicista nas vias-alvo por meio do resgate fenotípico e da segregação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na função conservada e na farmacabilidade em modelos evolutivamente distantes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação de nematódeos e técnicas de microinjeção para entrega específica ao gonad.
- Depende de aparelho de microinjeção, regulação de pressão de nitrogênio e preparação de agulhas capilares.
- Necessita protocolos padronizados para preparação de DNA/RNA, incluindo digestão com enzimas de restrição e precipitação com etanol.
- Envolve coordenação entre equipes para manutenção de linhagens, triagem fenotípica e rastreamento geracional.
- Limitado pela migração ventral dos gonads didélficos, exigindo injeção bilateral para transmissão germinativa consistente.
