Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato
13 de setembro de 2011
Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.
O objetivo geral deste procedimento é mapear simultaneamente, por meio óptico, o potencial transmembranar e a transiente de cálcio intracelular em corações de camundongo isolados e perfundidos intactos com LOR. Isso é realizado primeiramente removendo o coração de camundongo intacto, seguido pelo cânulamento da aorta e início da perfusão com LOR. O próximo passo é imobilizar o coração carregando um acoplador de excitação-contração e, em seguida, fixando o coração na câmara de perfusão.
As etapas finais consistem em carregar os corantes ópticos e fazer preparações para reduzir artefatos de movimento durante o experimento. As imagens ópticas são obtidas coletando a luz emitida pelo coração com câmeras my cam Ultima LC Moss. Ei, meu nome é di.
Sou estudante de pós-graduação na Universidade de Washington. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como o microeletrodo, é que o mapeamento óptico permite uma maior resolução espacial em toda a superfície do coração. Olá, sou Matt Sulkin.
Sou estudante de pós-graduação na Universidade de Washington. Este método, se realizado corretamente, pode ajudar a responder muitas questões na eletrofisiologia cardíaca, como a base da arritmogênese. Comece configurando uma bomba peristáltica para circular as soluções a 40 mililitros por minuto.
Em seguida, ajuste uma segunda bomba peristáltica para 80 mililitros por minuto. Esta bomba devolve o Perfuse oito de volta ao reservatório de armazenamento e oxigenação. Ligue as bombas e lave o sistema com um litro de etanol 70% durante 30 minutos com recirculação.
Após esta lavagem, siga com dois litros de água deionizada sem recirculação. Após a evacuação da água, circule dois litros de solução Tyro e passe-a por um filtro de cinco mícrons. Aqueça o perfusato de oito a 37 graus Celsius com uma jaqueta de água e borbulhe gás oxigenado na solução por meio de um circulador.
Ajuste a taxa de borbulhamento do gás para manter o pH em 7,35 mais ou menos 0,05. Monitore tanto o pH quanto a temperatura durante o experimento. O aparelho de mapeamento óptico duplo consiste em duas câmeras C moss de alta velocidade que podem capturar uma imagem de 100 por 100 pixels a 3000 quadros por segundo.
Acople um filtro de passagem de banda à câmera de imagem de cálcio e acople um filtro de passagem longa à câmera de imagem de voltagem em um suporte duplo para câmeras. Acople um espelho dicrômico e uma lente para que a luz de emissão proveniente do coração seja focalizada sobre o espelho pela lente. Além disso, acople duas câmeras ao suporte e posicione-as de modo que fiquem perpendiculares uma à outra.
A seguir, configure a luz de excitação. A luz é gerada por uma lâmpada de halogênio e direcionada através de um guia de luz flexível. Passe a luz por um filtro de calor, um obturador para limitar a exposição e um filtro de passagem de banda de excitação.
Por fim, prepare eletrodos de prata e cloreto de prata instalando-os na câmara. Após verificar e ajustar cuidadosamente os níveis nos amplificadores e filtros, a montagem está pronta para receber um coração. Utilize uma mistura de ketamina e xilazina com 100 unidades de heparina para anestesiar um camundongo antes de prosseguir.
Certifique-se de que o animal não apresenta reflexo de dor utilizando uma pinça no dedo do pé. Após fazer uma incisão mediana esternal, remova rapidamente o coração e os tecidos circundantes. Em seguida, usando um microscópio de dissecação rapidamente, identifique a aorta e faça um corte limpo na aorta ascendente abaixo da artéria subclávia direita.
Agora, fixe um pequeno segmento da aorta a uma cânula personalizada de 21 gauge utilizando quatro pontos de seda preta trançada. Após a cânulagem, realize a perfusão retrograda e a superperfusão do coração. Com solução de Tyro, ajuste a taxa de fluxo para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 milímetros de mercúrio, conforme medido por um transdutor de pressão.
Agora, dissecar e remover o timo pulmonar circundante e o tecido adiposo. Em seguida, inserir um tubo de silicone no ventrículo esquerdo através das veias pulmonares. Suture o tubo ao tecido conjuntivo próximo.
Esta etapa muito importante evita o congestionamento e a acidificação do Perfuse oito aprisionado no ventrículo esquerdo, especialmente após a supressão das contrações ventriculares. Para impedir os movimentos cardíacos induzidos pelo Perfuse oito, fixe o coração no fundo da câmara de perfusão revestida com protetor de soleira pelo seu ápice. Além disso, estique e fixe as orelhas auriculares direita e esquerda para aumentar a área de superfície das aurículas na configuração ereta.
Isso maximizará a área da superfície de gravação. Para realizar as estimulações de marcação, fixe um eletrodo personalizado na superfície do coração. Para reduzir artefatos de movimento, fixe um pequeno cubre-objeto sobre o coração na superfície da solução.
Faça isso inserindo o vidro entre vários pinos. Como preparação final, foque a luz de excitação no coração e posicione as câmeras para obter uma imagem óptica, então inicie o carregamento do corante enquanto carrega os dies. Monitore continuamente os registros de ECG para garantir a função elétrica normal do coração.
Inicie aquecendo os BLEs estatina até a temperatura ambiente. Em seguida, misture meio mililitro de BLEs estatina ao oito profuso no reservatório de armazenamento e dilua o restante, um décimo de mililitro de BLEs estatina, em um mililitro de solução Tyros. Durante os próximos 20 minutos, injete lentamente os BLEs estatina em Tyros através de um porto de administração de fármaco próximo à cânula.
O estatina BLE reduzirá gradualmente o artefato de movimento. Em seguida, dilua 30 microlitros de corante sensível à voltagem em uma solução Tyro de um mililitro e injete lentamente essa mistura ao longo de cinco a sete minutos no mesmo portão de droga. Depois, prepare novamente a mesma mistura.
Desta vez, adicione mais 30 microlitros de indicador de cálcio. Aplique lentamente esta mistura ao longo de cinco a 10 minutos pelo mesmo orifício. Após a injeção do indicador de cálcio, aguarde mais cinco a 10 minutos para que a estatina BLE suprima completamente o movimento e para que os corantes entrem nas células antes de prosseguir com o experimento.
Este preparo cardíaco foi realizado. De acordo com o protocolo, sinais de ECG foram registrados durante o estímulo de marcação ventricular de S um a S um. Potenciais de ação e sinais transitórios de cálcio foram registrados das átrios à esquerda e dos ventrículos à direita.
A seta indica onde ocorreu a dispersão do sinal proveniente dos ventrículos ao agrupar as gravações da câmera em unidades de três pixels por três pixels, permitindo exibir uma matriz de transientes de cálcio e potenciais de ação a partir dos dados da matriz. Pode-se construir uma figura que mostre a condução do potencial de ação. Dados de três pontos consecutivos nos eixos transversal e longitudinal mostram a alteração da amplitude com a propagação do potencial de ação sobre uma superfície ventricular.
Da mesma forma, pode-se construir uma figura mostrando as durações do potencial de ação e dos transientes de cálcio. Isso mostra uma condição controle à esquerda e à direita. Foi administrada uma injeção de isoproterenol no coração, o que claramente encurta a duração tanto dos transientes de cálcio quanto dos potenciais de ação.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas a três horas seguindo este procedimento. Outros métodos, como o protocolo de estimulação, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como aquelas relativas ao período refratário do nó AV.
Visão Geral
Este estudo apresenta um procedimento detalhado para mapeamento óptico do potencial transmembranar e dos transientes de cálcio intracelular em corações de camundongos isolados perfundidos pelo método de Langendorff. O método melhora a resolução espacial em comparação com técnicas tradicionais, fornecendo insights sobre a eletrofisiologia cardíaca.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Eletrofisiologia Cardíaca
- Técnicas de Mapeamento Óptico
- Modelos de Coração de Camundongo
Antecedentes
- O mapeamento óptico permite a medição simultânea do Vm e do CaT.
- Métodos tradicionais como microeletrodos apresentam limitações na resolução espacial.
- Essa técnica pode ajudar a investigar a arritmogênese.
- A perfusão Langendorff mantém a viabilidade cardíaca para experimentos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para mapeamento óptico em corações de camundongos.
- Aprimorar a compreensão da atividade elétrica cardíaca.
- Facilitar a pesquisa sobre os mecanismos de arritmias.
Métodos Utilizados
- Ressecção e cânulagem do coração de camundongo para perfusão.
- Uso de câmeras de alta velocidade para capturar imagens ópticas.
- Carregamento de corantes ópticos para visualizar o potencial transmembranar e os transientes de cálcio.
- Monitoramento de pH e temperatura durante o experimento.
Resultados Principais
- Mapeamento óptico bem-sucedido de Vm e CaT no coração isolado.
- Demonstração de artefatos de movimento reduzidos com a aplicação do corante.
- Registros eficazes de potenciais de ação e sinais de transientes de cálcio.
- Validação do método para estudos eletrofisiológicos futuros.
Conclusões
- A técnica de mapeamento óptico fornece alta resolução espacial.
- Este método pode avançar a pesquisa em eletrofisiologia cardíaca.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para explorar a arritmogênese.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O mapeamento óptico do potencial transmembrana e dos transientes de cálcio em corações de camundongos fornece dados espaciais e temporais de alta resolução, essenciais para a desmistificação mecanicista na validação de alvos cardiovasculares. Esta abordagem permite a avaliação quantitativa de fenótipos eletrofisiológicos, reforçando a confiança preditiva em modelos pré-clínicos de arritmia e insuficiência cardíaca. Ao registrar simultaneamente as dinâmicas de Vm e CaT, o método conecta a biologia descritiva com o alinhamento de biomarcadores translacionais em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento da dinâmica dos potenciais de ação e dos transientes de cálcio em tecido cardíaco.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da visualização simultânea de parâmetros do acoplamento excitação-contração.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao vincular perturbações moleculares a respostas funcionais eletrofisiológicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação de compostos em etapas subsequentes por meio da aquisição padronizada de sinais ópticos.
- Saídas Quantitativas: Gera medições reprodutíveis da duração do potencial de ação, velocidade de condução e amplitude do transiente de cálcio.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diversos modelos de doenças cardíacas por meio de protocolos consistentes de perfusão Langendorff e carregamento de corante.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a estudos de insuficiência cardíaca, arritmias e doenças metabólicas utilizando modelos de camundongos geneticamente modificados.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas mecanicistas da fase inicial à validação pré-clínica por meio da preservação da arquitetura tecidual e da perfusão fisiológica.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço ao quantificar precocemente a suscetibilidade eletrofisiológica no início do processo de descoberta.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica de eficácia, permitindo o refinamento iterativo de candidatos cardiovasculares com base em leituras funcionais eletrofisiológicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos mecanicistas por meio da correlação entre intervenções genéticas ou farmacológicas e padrões eletrofisiológicos espaciais.
- Triagem: Oferece padronização de ensaios e resultados quantitativos essenciais para triagem confiável de compostos na descoberta de canais iônicos e moduladores.
- Análises: Fornece medidas espaço-temporais do Vm e do CaT que permitem análise comparativa entre condições experimentais e genótipos.
- Pesquisa Translacional: Mantém a relevância fisiológica por meio da perfusão Langendorff, apoiando a extrapolação para respostas de órgãos intactos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de fenotipagem eletrofisiológica aplicável a múltiplos projetos cardiovasculares e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na eletrofisiologia cardíaca.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros definidos de perfusão, carregamento com corante e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao identificar precocemente falhas eletrofisiológicas antes de investimentos significativos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em perfis quantitativos de potenciais de ação e transientes de cálcio.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação cardíaca, perfusão Langendorff e sistemas de imagem óptica.
- Depende de câmeras CMOS de alta velocidade, fontes de luz de excitação e conjuntos de filtros ópticos para detecção em dois canais.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de carregamento de corantes e das estratégias de redução de artefatos de movimento.
- Envolve considerações de adaptação ao ser traduzido para diferentes linhagens de camundongos ou modelos de doenças com fisiologia cardíaca alterada.
- Inclui limitações práticas, como toxicidade do corante, fotodesvanecimento e a necessidade de supressão meticulosa de movimento para manter a qualidade dos dados.
