Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato
September 13th, 2011
Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.
O objetivo geral deste procedimento é mapear simultaneamente opticamente o potencial transmembrana e o transiente de cálcio intracelular em corações de camundongos perfundidos com LOR isolados intactos. Isso é feito primeiro extirpando o coração intacto do camundongo, depois canulando a aorta e iniciando a perfusão LOR. O próximo passo é imobilizar o coração carregando uma contração de excitação no acoplador e, em seguida, prendendo o coração na câmara de perfusão.
As etapas finais são carregar os corantes ópticos e fazer preparativos para reduzir os artefatos de movimento durante o experimento. As imagens ópticas são obtidas coletando a luz emitida pelo coração com minhas câmeras cam Ultima LC Moss. Ei, meu nome é di.
Sou estudante de pós-graduação na Universidade de Washington. A principal vantagem dessa técnica em relação ao método existente, como o microeletrodo, é que o mapeamento óptico permite maior resolução espacial em toda a superfície do coração. Olá, sou Matt Sulkin.
Sou estudante de pós-graduação na Universidade de Washington. Este método, se feito corretamente, pode ajudar a responder a muitas perguntas em eletrofisiologia cardíaca, como a base da arritmogênese. Comece configurando uma bomba peristáltica para circular as soluções a 40 mililitros por minuto.
Em seguida, defina uma segunda bomba peristáltica para 80 mililitros por minuto. Esta bomba retorna o Perfuse oito de volta ao reservatório de retenção e oxigenação. Ligue as bombas e lave o sistema com um litro, 70% de etanol por 30 minutos com recirculação.
Siga esta lavagem com dois litros de água deionizada sem recirculação. Assim que a água for evacuada, circule dois litros de solução de Tyro e passe-a por um filtro de cinco mícrons. Aqueça o perfuso de oito a 37 graus Celsius com uma camisa de água e gás oxigenado por bolha circuladora na solução.
Ajuste a taxa de borbulhamento do gás para manter o pH em 7,35 mais ou menos 0,05. Monitore o pH e a temperatura durante o experimento. O aparelho de mapeamento óptico duplo consiste em duas câmeras C moss de alta velocidade que podem capturar uma imagem de 100 por 100 pixels a 3000 quadros por segundo.
Conecte um filtro passa-banda à câmera de imagem de cálcio e conecte um filtro passa-longo à câmera de imagem de tensão em um suporte de câmera duplo. Conecte um espelho diic e uma lente de modo que a luz de emissão proveniente do coração seja focada no espelho pela lente. Além disso, conecte duas câmeras ao suporte e organize-as de forma que fiquem perpendiculares uma à outra.
Em seguida, configure a luz de excitação. A luz é gerada por uma lâmpada halógena e direcionada através de um guia de luz flexível. Passe a luz por um filtro de calor, um obturador para limitar a exposição e um filtro passa-banda de excitação.
Por fim, prepare eletrodos de prata e cloreto de prata instalando-os na câmara. Depois de verificar e ajustar os níveis nos amplificadores e filtros, a configuração está pronta para um coração. Use um coquetel de cetamina e xilazina com 100 unidades de heparina para anestesiar um camundongo antes de prosseguir.
Certifique-se de que o animal não tenha reflexo de dor usando uma pitada no dedo do pé. Depois de fazer uma incisão esternal média, remova rapidamente o coração e os tecidos circundantes. Em seguida, usando o microscópio de dissecação rapidamente, identifique a aorta e faça um corte limpo na aorta ascendente abaixo da artéria subclávia direita.
Agora prenda uma pequena seção de aorta a uma cânula de calibre 21 feita sob medida usando quatro suturas de seda trançadas pretas Após a canulação retro muito perfu e super fundir o coração. Com a solução Tyro, ajuste a taxa de fluxo para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 milímetros. Mercúrio medido por um transdutor de pressão.
Agora disseque e remova o timo pulmonar circundante e o tecido adiposo. Agora insira um tubo de silicone no ventrículo esquerdo através das veias pulmonares. Suture o tubo no tecido conjuntivo próximo.
Este passo muito importante evita a congestão e acidificação do Perfuse oito preso no ventrículo esquerdo, especialmente após a supressão das contrações ventriculares. Para evitar movimentos cardíacos induzidos pelo Perfuse oito, prenda o coração na parte inferior da câmara de perfusão revestida com proteção de soleira em seu ápice. Além disso, estique e prenda os apêndices atriais direito e esquerdo para aumentar a área de superfície dos átrios na configuração vertical.
Isso maximizará a área da superfície de gravação. Para conduzir as estimulações de estimulação, conecte um eletrodo personalizado à superfície do coração. Para reduzir os artefatos de movimento, fixe uma pequena lamínula sobre o coração na superfície da solução.
Faça isso prendendo o vidro entre vários pinos. Como preparativos finais, concentre a luz de excitação no coração e posicione as câmeras para obter uma imagem óptica e, em seguida, comece a carregar o corante enquanto carrega as matrizes. Monitore continuamente as gravações de ECG para garantir a função elétrica normal do coração.
Comece aquecendo a estatina BLEs à temperatura ambiente. Em seguida, misture meio mililitro de estatina BLEs nos oito profusos no reservatório de retenção e dilua o 10º mililitro restante de estatina BLEs em um mililitro de solução de Tyros. Nos próximos 20 minutos, injete lentamente a estatina BLEs em tyros através de uma porta de droga perto da cânula.
A estatina BLEs reduzirá gradualmente o artefato de movimento. Em seguida, dilua 30 microlitros de corante sensível à voltagem em uma solução de mililitro de tirano e injete lentamente essa mistura por cinco a sete minutos na mesma porta do medicamento. Em seguida, faça a mesma mistura novamente.
Desta vez, adicionando mais 30 microlitros de indicador de cálcio. Aplique lentamente esta mistura por cinco a 10 minutos pela mesma porta. Depois que o indicador de cálcio for injetado, aguarde mais cinco a 10 minutos para que a estatina BLEs suprima totalmente o movimento e para que os corantes entrem nas células antes de prosseguir com o experimento.
Esta preparação do coração foi feita. De acordo com o protocolo, os sinais de ECG foram registrados durante a estimulação ventricular a partir de uma estimulação S one S. Os potenciais de ação e os sinais transitórios de cálcio foram registrados nos átrios à esquerda e nos ventrículos à direita.
A seta mostra onde ocorreu o espalhamento do sinal dos ventrículos, agrupando as gravações da câmera em unidades de três pixels por três pixels, uma matriz de transientes de cálcio e potenciais de ação podem ser exibidos a partir dos dados da matriz. Uma figura mostrando a condução do potencial de ação pode ser construída. Dados de três pontos consecutivos no eixo transversal e longitudinal mostram a mudança de amplitude com a propagação do potencial de ação através de uma superfície ventricular.
Da mesma forma, uma figura mostrando o potencial de ação e as durações transitórias do cálcio pode ser construída. Isso mostra uma condição de controle à esquerda à direita. Uma injeção de isoproterenol foi administrada ao coração, o que reduz claramente a duração dos transientes de cálcio e dos potenciais de ação.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas a três horas Após este procedimento. Outros métodos, como o protocolo de estimulação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como as relacionadas ao período refratário do nó AV.
Visão geral
Este estudo apresenta um procedimento detalhado para mapeamento óptico do potencial transmembranar e transientes de cálcio intracelular em corações de camundongo isolados perfundidos por Langendorff. O método melhora a resolução espacial em comparação com técnicas tradicionais, fornecendo insights sobre a eletrofisiologia cardíaca.
Principais componentes do estudo
Área da ciência
- Eletrofisiologia cardíaca
- Técnicas de mapeamento óptico
- Modelos de coração de camundongo
Fundamentos
- O mapeamento óptico permite a medição simultânea de Vm e CaT.
- Métodos tradicionais como microeletrodos têm limitações na resolução espacial.
- Esta técnica pode ajudar a investigar a arritmogênese.
- A perfusão de Langendorff mantém a viabilidade do coração para experimentos.
Objetivo do estudo
- Desenvolver um método confiável para mapeamento óptico em corações de camundongo.
- Melhorar a compreensão da atividade elétrica cardíaca.
- Facilitar a pesquisa sobre os mecanismos das arritmias.
Métodos utilizados
- Excisão e canulação do coração de camundongo para perfusão.
- Uso de câmeras de alta velocidade para capturar imagens ópticas.
- Carga de corantes ópticos para visualizar o potencial transmembranar e os transientes de cálcio.
- Monitoramento do pH e temperatura durante o experimento.
Principais resultados
- Mapeamento óptico bem-sucedido de Vm e CaT no coração isolado.
- Artefatos de movimento reduzidos demonstrados com a aplicação do corante.
- Potenciais de ação e sinais de transientes de cálcio registrados efetivamente.
- Método validado para futuros estudos eletrofisiológicos.
Conclusões
- A técnica de mapeamento óptico fornece alta resolução espacial.
- Este método pode avançar a pesquisa em eletrofisiologia cardíaca.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para explorar a arritmogênese.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Optical mapping of transmembrane potential and calcium transients in mouse hearts provides high-resolution spatial and temporal data critical for mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. This approach enables quantitative assessment of electrophysiological phenotypes, supporting predictive confidence in preclinical models of arrhythmia and heart failure. By capturing concurrent Vm and CaT dynamics, the method bridges discovery biology with translational biomarker alignment in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping action potential and calcium transient dynamics across cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous visualization of excitation-contraction coupling parameters.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking molecular perturbations to functional electrophysiological outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized optical signal acquisition.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible measurements of action potential duration, conduction velocity, and calcium transient amplitude.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cardiac disease models through consistent Langendorff perfusion and dye loading protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studies of heart failure, arrhythmias, and metabolic disease using genetically engineered mouse models.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through preserved tissue architecture and physiological perfusion.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying electrophysiological liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of cardiovascular candidates based on functional electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by correlating genetic or pharmacological interventions with spatial electrophysiological patterns.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in ion channel and modulator discovery.
- Analytics: Provides spatiotemporal measurements of Vm and CaT that enable comparative analysis across experimental conditions and genotypes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through Langendorff perfusion, supporting extrapolation to intact organ responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological phenotyping capability applicable across multiple cardiovascular projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, dye loading, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying electrophysiological liabilities prior to significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative action potential and calcium transient profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, Langendorff perfusion, and optical imaging systems.
- Dependent on high-speed CMOS cameras, excitation light sources, and optical filter sets for dual-channel detection.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading protocols and motion artifact reduction strategies.
- Involves adaptation considerations when translating to different mouse strains or disease models with altered cardiac physiology.
- Includes practical limitations such as dye toxicity, photobleaching, and the need for meticulous motion suppression to maintain data quality.
