Name: Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda mapeamento óptico de potencial de membrana e transientes de cálcio em corações isolados de camundongo perfundidos por Langendorff. Esta técnica oferece alta resolução espacial para estudos de eletrofisiologia cardíaca.

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NIH concede R01 HL085369.

1. Preparação prévia das soluções de reserva <ol><li> Prepare duas soluções estoque de solução de Tyrode do (16x) de antecedência em água deionizada e armazená-los a 4 ° C: <ol class="lalpha"><li> Ações I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Lawn, científico Fair, NJ)); </li><li> Estoque II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). </li></ol></li><li> Preparar soluções estoque de corantes fluorescentes. Para evitar congelamento e descongelamento repetidos, nós armazenamos 30 mL alíquotas de ambos os corantes a -20 ° C, o que é suficiente para uma experiência: <ol class="lalpha"><li> Sensíveis à voltagem solução estoque de corante RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,25 mg / mL em dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); </li><li> Cálcio indicador Rhod-2:00 solução-mãe (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mg / ml de solução em DMSO. </li></ol></li><li> Prepare excitação-contração desacoplador solução estoque blebbistatin (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / mL em solução de DMSO) de antecedência e guardar o blebbistatin dissolvida a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparar soluções de perfusão e configuração experimental 7 <ol start="4"><li> Recém preparar solução Tyrode 2L do (128.2mM NaCl, 1,3 mM CaCl 2 (2H 2 O), 4,7 mm KCl, 1,05 mm MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, NaHCO 20mM 3, 11,1 mM de glicose-D em água deionizada, pH = 7,35 ± 0,05). Se a solução de ações está sendo usado para fazer 2L de solução de Tyrode do (suficiente para um experimento) Tomar 1750 mL de água deionizada e misturar em 125 mL de Ações I, 125 mL de Ações II, e 4g de glicose. </li><li> Ligue as duas bombas dos sistemas de perfusão. Definir a bomba peristáltica (Peri-Star, WPI, Sarasota, EUA) que é usado para perfusão retrógrada a 40 mL / min. Definir a bomba peristáltica outros (Cole-Parmer Masterflex Bomba Peristalic L / S, empresa Instrumento Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois) que é usado para superfusão e devolver o perfusato de volta para o reservatório de exploração para 80 mL / min. </li><li> Lavar o sistema de perfusão com etanol 70% por 30 min e depois com água deionizada 2L. </li><li> Uma vez que toda a água deionizada é evacuada da câmara, circula a solução Tyrode e passá-lo através de um filtro 5 mícrons (Millipore, Billerica, MA, EUA). Aqueça o perfusato a 37 ° C com uma jaqueta de água e circulador (ThermoNESLAB EX7, Newtown, EUA) e do perfusato a oxigenar por borbulhamento O 2 / CO 2 (95% / 5%) de gás na solução. Monitorar o pH da solução com um medidor de pH (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) e ajustar a taxa de O 2 / CO 2 borbulhando para manter o pH em 7,35 ± 0,05. Continue pHmetria e temperatura durante o experimento. </li><li> O aparelho de mapeamento de dupla óptica consiste em duas Micam Ultima-L CMOS câmeras (SciMedia, Costa Mesa, CA), que têm alta espacial (100x100 pixels, 230 ± 20 mM por pixel) e resolução (1.000-3.000 frames / seg) temporal. Fixar um filtro passa-banda (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) na frente da câmera designada imagem de cálcio, enquanto que, um filtro passa-tempo (&gt; 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) precisa ser posicionado na frente da câmera designada tensão de imagem. As câmeras são dispostos perpendicularmente uns aos outros por um titular, que contém um espelho dicróico (635 nm de corte, Omega Optical, Brattleboro, VT). Imediatamente abaixo do titular câmera dupla, há uma lente (Nikon Nikkor 55 milímetros 1:1.4 235.052), que concentra a emissão de luz que vem do coração para o espelho dicróico. A distância de trabalho é de aproximadamente três centímetros. A luz de excitação é gerada por uma lâmpada halógena (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) e é transmitida através de um filtro de calor, obturador, e filtro passa-banda (520 ± 45 nm). A guia de luz flexível direciona a luz passa-banda filtrada para a preparação, e um obturador é usada para garantir que a preparação é exposto à luz apenas durante a aquisição de imagem para evitar fotodegradação dos corantes. </li><li> Prepare Ag / AgCl 2 eletrodos para estimulação e detecção antecipada e instalá-los na câmara antes de colocar o coração. Certifique-se que amplificadores e filtros são ajustados para níveis apropriados. </li></ol> 3. Colheita do coração mouse, canular e configurar perfusão Langendorff <ol start="10"><li> Anestesiar o rato com cetamina / xilazina (cetamina, 80mg/kg de peso corporal; xilazina, 10 mg / kg) e heparina (100 unidades) por injeção intraperitoneal. Assegurar um nível adequado de anestesia com a falta de reflexo de dor. </li><li> Após uma incisão médio-esternal, remover rapidamente o coração e lave-o em oxigenada (95% O 2, 5% CO 2), a temperatura constante (37 ± 1 ° C) solução Tyrode é. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, Identificar rapidamente a aorta e fazer um corte limpo em toda a aorta ascendente abaixo da artéria subclávia direita. Uma pequena secção de aorta é então ligado a uma custom made 21 calibre da cânula com uma ponta queimado. Fio de seda preto trançado 4-0 (Corporação especialidades cirúrgicas, Reading, PA) é usado para corrigir o coração para a cânula. Após canulação, o coração é perfundido retrogradamente e superfused com solução Tyrode é. A taxa de perfusão retrógrada é ajustado na faixa de 2-5 mL / min para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 mmHg (transdutor de pressão, instrumentos de precisão Inc Mundial (WPI), Sarasota, EUA; Ponte Amplificador TBM4M, WPI, Sarasota, EUA). </li><li> Depois que o coração é canulada, pulmão, timo, tecido adiposo e são, então, dissecados e removidos. </li><li> O coração isolado é preso (Ferramentas Ciência Fine) no ápice para a parte inferior da câmara de perfusão (revestido Sylgard) para evitar fluxo induzido por movimento. Os apêndices atriais direito e esquerdo também são esticados e presos (Ferramentas Ciência Fine, Inc, Foster City, CA) para o fundo da câmara, que fornece superfície máxima para medidas ópticas dos átrios. Muito importante! Um pequeno tubo de silicone é inserida no ventrículo esquerdo através das veias pulmonares e fixado por fio de seda para o tecido conjuntivo nas proximidades. Isso evita que o congestionamento solução e acidificação do perfusato preso no ventrículo esquerdo, que é especialmente importante após a supressão das contracções ventriculares com um desacoplador excitação-contração (consulte a etapa Parte 4 19). </li><li> Um eletrodo feito sob medida é colocada sobre a superfície do coração para conduzir os estímulos ritmo, que é gerado pelo Mestre-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalém, Israel) ou 26T PowerLab (AD Instruments, Sydney, Austrália). </li><li> A tampa de vidro de pequeno porte é fixa na superfície da solução sobre o coração para reduzir artefatos de movimento a partir da solução de vibração. </li><li> O foco da luz de excitação sobre o coração. Além disso, ajustar a distância entre o aparelho de câmara dupla e do coração para que a resolução máxima será obtido. </li><li> Desligar todas as luzes na sala e iniciar as gravações elétrica usando PowerLab 26T. </li></ol> 4. Tensão de carga de cálcio e corantes sensíveis e excitação-contração desacoplador <ol start="19"><li> Warm-up de 0,6 mL blebbistatin. Misture 0,5 mL da blebbistatin com o perfusato no reservatório de retenção. Diluir a 0,1 mL restantes de blebbistatin em 1 mL de solução de Tyrode e injetá-la lentamente (ao longo de um período de 20 minutos) através de uma porta de drogas localizado perto da cânula. Observe como blebbistatin reduz gradualmente o artefato de movimento. </li><li> Diluir 30 mL da solução estoque de tensão sensíveis corante RH237 em solução 1 mL Tyrode e injectar lentamente ao longo de 5-7 minutos na porta de injeção mesma blebbistatin. </li><li> 30 mL de cálcio indicador Rhod-02:00 01:01 é misturado com PLURONIC F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, solução a 20% em DMSO) e, em seguida, diluídas em 1 ml de solução Tyrode e lentamente aplicado sobre min 10/05, através da porta de injeção mesmo . </li><li> Aguarde 5-10 minutos para blebbistatin e corantes para alcançar a membrana celular e citoplasma. Continue com o protocolo quando o movimento é completamente suprimida. </li><li> Continuamente gravações monitor ECG sobre todo o procedimento para garantir a função elétrica normal do coração. </li><li> Iniciar as gravações usando o sinal fluorescente SciMedia custom software (SciMedia, Costa Mesa, CA). </li></ol> 5. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Instalação experimental para a perfusão, gravações elétricas e mapeamento óptico. EM = emissões; Lp = longpass <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Preparação Experimental e exemplos sinal gravado durante a estimulação ventricular. Esquerda: Os sinais de ECG são coletados de Ag / AgCl dois eletrodos de disco (Top) e um exemplo de S1S1 protocolo de estimulação é mostrado (Bottom). Center: Langendorff preparação do coração mouse. Direita: Representante potenciais de ação óptica e sinais de cálcio transiente de átrios (Top) e ventrículos (Bottom) são mostrados. A seta amarela (Top) aponta para a dispersão de sinal fluorescente vinda dos ventrículos, que é visto nas gravações atrial. LV = ventrículo esquerdo, VD = ventrículo direito; LA = átrio esquerdo; RA = átrio direito <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante gravações ópticas de V m e CAT dos ventrículos do coração selvagem do tipo de mouse. A. A preparação experimental com uma série de pontos espaçados marcada por pontos pretos, cuja óptica gravações pode ser visto em (C). Exemplo B. rastreamento de V m eo gato de uma localização central na matriz (ver caixa in (C)). C. V m (azul) e CAT (vermelho) da série de pontos espaçados. Sinais foram binned 3x3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Mapa de ativação e de condução. A. Um mapa de ativação exemplo de um coração selvagem do tipo de mouse com transversal (T) e (L) longitudinal direções indicadas pelas setas brancas. Sinais B. V m (Top) e dV / dt (Bottom), correspondentes aos três pontos de vista em A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Potencial de ação e de cálcio análise de duração transitória. A. duração Ação potencial de 80% repolarização (APD80) e duração de cálcio transiente menos 80% de relaxamento (CaD80) mapas são mostrados de um coração em condições controle (esquerda) e depois de 30 nM isoproterenol aplicação (Direito). A cor amarela / verde nos ventrículos (direito) indica isoproterenol encurtado APD80 e CaD80. Exemplo B. traçados de APD80 e CaD80 dos ventrículos do tipo selvagem mouse (Top) e átrios (Bottom).

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste experimento nós modificamos o método de perfusão Langendorff adicionando um pequeno tubo de silicone, que é especialmente crucial depois da supressão das contracções ventriculares com um desacoplador excitação-contração. O tubo de silicone é usado para evitar o congestionamento solução, a acidificação da solução de perfusão, e desenvolvimento de isquemia do ventrículo esquerdo. O coração do mouse é muito sensível à hipotermia, assim, variações de temperatura em todo o coração vai causar diferenças artificial em durações potencial de ação. Conseqüentemente, um sistema de aquecimento foi implementado na câmara de perfusão, a fim de manter uma temperatura constante de 37 ° C durante a totalidade do experimento 8. Uma vez que um modelo Langendorff não retém a inervação do coração, é preciso considerar a adição de neurotransmissores para o perfusato, a fim de investigar o tônus ​​simpático e parassimpático fisiológicas 9. Além de perfusão retrógrada, a adição de superfusão do coração ajuda a manter adequados parâmetros ambientais tais como pH e temperatura. Neste método, o coração foi perfundido Langendorff horizontalmente colocado. Uma configuração de perfusão verticais Langendorff também pode ser usado 10, mas pode resultar em um pouco diferente mecânica cardíaca 11. Além de câmeras CMOS, detectores de alternativas também estão disponíveis e podem ser aplicados para mapear V m e CAT simultaneamente 12. Aplicação de câmeras CMOS de resolução espaço-temporal de alta garante a precisão das gravações, no entanto, sinais de mapeamento óptico não são de uma única célula. Ao contrário, cada sinal fluorescente vem de centenas ou milhares de células, dependendo de ampliação ótica. A fluorescência ventricular muito maior pode distorcer os sinais atrial pelo espalhamento óptico e, portanto, a interpretação cuidadosa dos sinais gravados oticamente é necessária. Outra limitação da preparação do mouse é a distorção de sinal e ruído induzido pela curvatura da superfície, devido ao pequeno tamanho do coração 13. Medições de velocidade de condução pode ser alterado não só a partir da curvatura do coração de rato, mas também da polaridade do eletrodo e eletrodos virtual. Para alcançar a precisão de velocidade de condução, anisotropia, ativação e repolarização mapas, correto foco da câmera na superfície do coração é essencial. Neste método, as gravações em tempo real ECG pode complementar a investigação óptica de eletrofisiologia cardíaca. Sensíveis à voltagem corante (RH237) e indicador de cálcio (Rhod-2:00) são utilizados no protocolo por causa de sua rápida resposta, excitação semelhante, e espectros de emissão de 3,7. Existem combinações alternativas de corantes que podem ser usados ​​para medir V m e CAT que não RH237 e-Rhod 02:00 3. Um corante sensíveis à voltagem romance, PGHI, com uma grande mudança do Stoke (&gt; 200 nm) foi encontrada para permitir uma melhor m V e sinais de CaT, devido à maior separação entre os comprimentos de onda de emissão entre PGHI e Rhod-2:00 14. Melhoramentos futuros podem se concentrar em explorar novas sondas fluorescentes, o desenvolvimento de detectores de novas imagens, e software de processamento melhorado a imagem. Maior resolução e novas modalidades de imagem óptico para o mapeamento óptico 3D também são importantes direções futuras de mapeamento óptico 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> Técnica S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-02:00 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> PLURONIC F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

O coração do rato é um modelo popular para estudos cardiovasculares, devido à existência de tecnologia de baixo custo para a engenharia genética nesta espécie. Fenotipagem fisiológicas cardiovasculares do coração do mouse pode ser feito facilmente usando imagens de fluorescência empregando várias sondas para potenciais transmembrana (V m), transientes de cálcio (CAT), e outros parâmetros. Excitação-contração de acoplamento é caracterizado pela dinâmica do potencial de ação e intracelular de cálcio e, portanto, é extremamente importante para mapear tanto m V e CAT simultaneamente a partir do mesmo local no coração 1-4. Mapeamento óptica simultânea de Langendorff perfundidos corações do rato tem o potencial para elucidar os mecanismos subjacentes insuficiência cardíaca, arritmias, doença metabólica e outras doenças cardíacas. Visualização de ativação, velocidade de condução, a duração do potencial de ação, e outros parâmetros em uma infinidade de sites não pode ser alcançado a partir de investigação nível celular, mas é bem resolvido pelo mapeamento óptico 1,5,6. Neste artigo apresentamos a configuração de instrumentação e das condições experimentais para o mapeamento de óptica simultânea de V m e CAT nos corações do rato com a resolução espaço-temporal de alta usando state-of-the-art tecnologia de imagens CMOS. Consistente gravações ópticas obtidas com este método ilustrar que o mapeamento simultâneas óptico de corações de camundongos perfundidos Langendorff é viável e confiável.

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

O coração de camundongo é um modelo popular para estudos cardiovasculares devido à existência de tecnologia de baixo custo para engenharia genética nesta espécie. ...

O objetivo geral deste procedimento é mapear simultaneamente, por meio óptico, o potencial transmembranar e a transiente de cálcio intracelular em corações de camundongo isolados e perfundidos intactos com LOR. Isso é realizado primeiramente removendo o coração de camundongo intacto, seguido pelo cânulamento da aorta e início da perfusão com LOR. O próximo passo é imobilizar o coração carregando um acoplador de excitação-contração e, em seguida, fixando o coração na câmara de perfusão.As etapas finais consistem em carregar os corantes ópticos e fazer preparações para reduzir artefatos de movimento durante o experimento. As imagens ópticas são obtidas coletando a luz emitida pelo coração com câmeras my cam Ultima LC Moss. Ei, meu nome é di.Sou estudante de pós-graduação na Universidade de Washington. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como o microeletrodo, é que o mapeamento óptico permite uma maior resolução espacial em toda a superfície do coração. Olá, sou Matt Sulkin.Sou estudante de pós-graduação na Universidade de Washington. Este método, se realizado corretamente, pode ajudar a responder muitas questões na eletrofisiologia cardíaca, como a base da arritmogênese. Comece configurando uma bomba peristáltica para circular as soluções a 40 mililitros por minuto.Em seguida, ajuste uma segunda bomba peristáltica para 80 mililitros por minuto. Esta bomba devolve o Perfuse oito de volta ao reservatório de armazenamento e oxigenação. Ligue as bombas e lave o sistema com um litro de etanol 70% durante 30 minutos com recirculação.Após esta lavagem, siga com dois litros de água deionizada sem recirculação. Após a evacuação da água, circule dois litros de solução Tyro e passe-a por um filtro de cinco mícrons. Aqueça o perfusato de oito a 37 graus Celsius com uma jaqueta de água e borbulhe gás oxigenado na solução por meio de um circulador.Ajuste a taxa de borbulhamento do gás para manter o pH em 7,35 mais ou menos 0,05. Monitore tanto o pH quanto a temperatura durante o experimento. O aparelho de mapeamento óptico duplo consiste em duas câmeras C moss de alta velocidade que podem capturar uma imagem de 100 por 100 pixels a 3000 quadros por segundo.Acople um filtro de passagem de banda à câmera de imagem de cálcio e acople um filtro de passagem longa à câmera de imagem de voltagem em um suporte duplo para câmeras. Acople um espelho dicrômico e uma lente para que a luz de emissão proveniente do coração seja focalizada sobre o espelho pela lente. Além disso, acople duas câmeras ao suporte e posicione-as de modo que fiquem perpendiculares uma à outra.A seguir, configure a luz de excitação. A luz é gerada por uma lâmpada de halogênio e direcionada através de um guia de luz flexível. Passe a luz por um filtro de calor, um obturador para limitar a exposição e um filtro de passagem de banda de excitação.Por fim, prepare eletrodos de prata e cloreto de prata instalando-os na câmara. Após verificar e ajustar cuidadosamente os níveis nos amplificadores e filtros, a montagem está pronta para receber um coração. Utilize uma mistura de ketamina e xilazina com 100 unidades de heparina para anestesiar um camundongo antes de prosseguir.Certifique-se de que o animal não apresenta reflexo de dor utilizando uma pinça no dedo do pé. Após fazer uma incisão mediana esternal, remova rapidamente o coração e os tecidos circundantes. Em seguida, usando um microscópio de dissecação rapidamente, identifique a aorta e faça um corte limpo na aorta ascendente abaixo da artéria subclávia direita.Agora, fixe um pequeno segmento da aorta a uma cânula personalizada de 21 gauge utilizando quatro pontos de seda preta trançada. Após a cânulagem, realize a perfusão retrograda e a superperfusão do coração. Com solução de Tyro, ajuste a taxa de fluxo para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 milímetros de mercúrio, conforme medido por um transdutor de pressão.Agora, dissecar e remover o timo pulmonar circundante e o tecido adiposo. Em seguida, inserir um tubo de silicone no ventrículo esquerdo através das veias pulmonares. Suture o tubo ao tecido conjuntivo próximo.Esta etapa muito importante evita o congestionamento e a acidificação do Perfuse oito aprisionado no ventrículo esquerdo, especialmente após a supressão das contrações ventriculares. Para impedir os movimentos cardíacos induzidos pelo Perfuse oito, fixe o coração no fundo da câmara de perfusão revestida com protetor de soleira pelo seu ápice. Além disso, estique e fixe as orelhas auriculares direita e esquerda para aumentar a área de superfície das aurículas na configuração ereta.Isso maximizará a área da superfície de gravação. Para realizar as estimulações de marcação, fixe um eletrodo personalizado na superfície do coração. Para reduzir artefatos de movimento, fixe um pequeno cubre-objeto sobre o coração na superfície da solução.Faça isso inserindo o vidro entre vários pinos. Como preparação final, foque a luz de excitação no coração e posicione as câmeras para obter uma imagem óptica, então inicie o carregamento do corante enquanto carrega os dies. Monitore continuamente os registros de ECG para garantir a função elétrica normal do coração.Inicie aquecendo os BLEs estatina até a temperatura ambiente. Em seguida, misture meio mililitro de BLEs estatina ao oito profuso no reservatório de armazenamento e dilua o restante, um décimo de mililitro de BLEs estatina, em um mililitro de solução Tyros. Durante os próximos 20 minutos, injete lentamente os BLEs estatina em Tyros através de um porto de administração de fármaco próximo à cânula.O estatina BLE reduzirá gradualmente o artefato de movimento. Em seguida, dilua 30 microlitros de corante sensível à voltagem em uma solução Tyro de um mililitro e injete lentamente essa mistura ao longo de cinco a sete minutos no mesmo portão de droga. Depois, prepare novamente a mesma mistura.Desta vez, adicione mais 30 microlitros de indicador de cálcio. Aplique lentamente esta mistura ao longo de cinco a 10 minutos pelo mesmo orifício. Após a injeção do indicador de cálcio, aguarde mais cinco a 10 minutos para que a estatina BLE suprima completamente o movimento e para que os corantes entrem nas células antes de prosseguir com o experimento.Este preparo cardíaco foi realizado. De acordo com o protocolo, sinais de ECG foram registrados durante o estímulo de marcação ventricular de S um a S um. Potenciais de ação e sinais transitórios de cálcio foram registrados das átrios à esquerda e dos ventrículos à direita.A seta indica onde ocorreu a dispersão do sinal proveniente dos ventrículos ao agrupar as gravações da câmera em unidades de três pixels por três pixels, permitindo exibir uma matriz de transientes de cálcio e potenciais de ação a partir dos dados da matriz. Pode-se construir uma figura que mostre a condução do potencial de ação. Dados de três pontos consecutivos nos eixos transversal e longitudinal mostram a alteração da amplitude com a propagação do potencial de ação sobre uma superfície ventricular.Da mesma forma, pode-se construir uma figura mostrando as durações do potencial de ação e dos transientes de cálcio. Isso mostra uma condição controle à esquerda e à direita. Foi administrada uma injeção de isoproterenol no coração, o que claramente encurta a duração tanto dos transientes de cálcio quanto dos potenciais de ação.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas a três horas seguindo este procedimento. Outros métodos, como o protocolo de estimulação, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como aquelas relativas ao período refratário do nó AV.

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